一种优质乳制品中过氧化氢酶活力的测定方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，公开了一种优质乳制品中过氧化氢酶活力的测定方法，其技术要点是：移取定量待测牛奶放置入容器中，标记为A组；移取相同定量存放灭菌牛奶放置入容器中，标记为B组，在A组中添加缓冲液并充分搅拌，并静置；在B组中添加相同缓冲液并充分搅拌，并静置，在A组中添加过氧化氢，并进行水浴加热；在B组中添加相同过氧化氢，并进行水浴加热，将乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液依次加入A组中；将相同量的乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液依次加入B组中，再滴定。实现了操作简单，在测量乳制品过氧化氢酶活力中准确度提高20％左右，同一批次间稳定度大幅度提高，不需要绘制标准曲线，仅通过换算即可测出过氧化氢酶活力的技术效果。

【技术实现步骤摘要】
一种优质乳制品中过氧化氢酶活力的测定方法
本专利技术涉及生物检测
，具体的讲是一种优质乳制品中过氧化氢酶活力的测定方法。
技术介绍
过氧化氢酶(CAT)是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2危害。CAT作用于过氧化氢的机理实质上是H2O2的歧化，必须有两个H2O2先后与CAT应。H2O2浓度越高，分解速度越快。奶牛在生长过程中随着新陈代谢会产生一些有害物质，这些有害物质只有快速进行清除，奶牛才能维持正常的生命活动。乳及乳制品中过氧化氢是一种有害物质，对人体危害极大，需要被快速的分解。过氧化氢酶能够催化过氧化氢快速分解为分子氧和水。是生物防御体系的关键酶之一。现有过氧化氢酶活力的测定方法多使用紫外法进行测定，但是乳制品过氧化氢酶检验中紫外法存在一定不足，在实际操作中，频发吸光度值混乱的问题，经过检验为H2O2反应不彻底，紫外分光器波长较难匹配乳制品。除了紫外法之外，现有技术还提供了一种紫外法和滴定法相结合的方法，过氧化氢酶活性的检测方法(中国专利公开号CN104297185A)，公开了一种基于吸光度值和绘制标准曲线从而测算出过氧化氢酶活性。这种方法主要是针对实验溶液中的过氧化氢酶，但是实际操作中如乳制品，其中含有较多的脂肪和蛋白质，生物环境复杂存在较多干扰因素，导致吸光度值出现混乱，检测结果错误频发，且通过绘制标准曲线操作过于复杂，需要具有较高相关专业知识水平和相应的经验。这样的人才企业往往需要长时间培养，增加了企业负担。因此，需要一种操作简单，在测量乳制品过氧化氢酶活力中准确度提高20％左右，同时同一批次间稳定度大幅度提高，不需要绘制标准曲线，仅通过换算即可测出过氧化氢酶活力的一种优质乳制品中过氧化氢酶活力的测定方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有紫外法、滴定法主要是针对实验溶液中的过氧化氢酶，但是实际操作中如乳制品，其中含有较多的脂肪和蛋白质，生物环境复杂存在较多干扰因素，导致吸光度值出现混乱，检测结果错误频发，且通过绘制标准曲线操作过于复杂，需要具有较高相关专业知识水平和相应的经验。这样的人才企业往往需要长时间培养，增加了企业负担的问题，提供一种优质乳制品中过氧化氢酶活力的测定方法。本专利技术解决上述技术问题，采用的技术方案是，一种优质乳制品中过氧化氢酶活力的测定方法，包括以下步骤：第一步，取样，移取定量待测牛奶放置入容器中，标记为A组；移取相同定量存放灭菌牛奶放置入容器中，标记为B组；第二步，添加缓冲液，在A组中添加缓冲液并充分搅拌，并静置；在B组中添加相同缓冲液并充分搅拌，并静置；第三步，添加过氧化氢，在A组中添加过氧化氢，并进行水浴加热；在B组中添加相同过氧化氢，并进行水浴加热；第四步，脂肪和蛋白质的沉淀，将乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液依次加入A组中，并进行过滤制得一号滤液；将相同量的乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液依次加入B组中，并进行过滤制得二号滤液；第五步，滴定，取定量一号滤液放入容器中依次添加离子水、浓度为50％硫酸水溶液，并混合均匀，使用高锰酸钾溶液进行滴定，记录高锰酸钾消耗量，标记为V1；取相同定量二号滤液放入容器中依次添加离子水、浓度为50％硫酸水溶液，并混合均匀，使用高锰酸钾溶液进行滴定，记录高锰酸钾消耗量，标记为V0；第六步，通过以下算式计算过氧化氢酶活力：X＝(V0-V1)×C×D×(E/F)其中：X为待测牛奶过氧化氢酶活力(mgH2O2/100ml)；V0为B组高锰酸钾消耗量(ml)；V1为A组高锰酸钾消耗量(ml)；C为高锰酸钾浓度(mol/L)；D为消耗1ml的C浓度高锰酸钾对应的双氧水的质量(mg)；E为第五步中取定量滤液体积(ml)；F为第五步中添加离子水体积(ml)。这样设计的目的在于，过氧化氢酶(catalase)属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧。在反应系统中加入过量的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的过氧化氢。从而准确计算乳制品中过氧化氢酶的活力。进一步的，第一步，移取100ml待测牛奶放入250ml锥形瓶中，移取相同定量存放3个月的灭菌乳放入250ml锥形瓶中。进一步的，第二步，缓冲液为磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的混合溶液。进一步的，缓冲液为11.876g/L的磷酸氢二钠与9.078g/L的磷酸二氢钾，按照体积比为8～10:1进行混合，混合后的缓冲液PH值为7.5～8。进一步的，第三步，加入200ul浓度为30％的过氧化氢，在35℃的环境下水浴加热60min，期间每20min搅拌一次。进一步的，第四步，乙酸锌溶液通过将91.5g乙酸锌(C4H6O4Zn.2H2O)溶解至500ml去离子水中制得，亚铁氰化钾溶液通过将46g亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6.3H2O)溶解至500ml去离子水中制得，通过使用定性滤纸进行过滤。这样设计的目的在于，通过添加乙酸锌和亚铁氰化钾对乳制品中的脂肪和蛋白质实现沉降，针对乳制品可以大幅提高后续滴定的准确性，提高了相同批次和奶源测量过氧化氢酶活力的稳定性。进一步的，第五步，取30ml滤液放入250ml锥形瓶中，加入150ml离子水，再加入10ml50％浓度的硫酸水溶液进行混合均匀，使用0.1mol/L的高锰酸钾进行滴定。进一步的，第五步，滴定至混合溶液粉红色并保持30s不褪色，记录高锰酸钾消耗的量。本专利技术的有益效果至少是以下之一：1.过氧化氢酶(catalase)属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧。在反应系统中加入过量的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用0.1mol/L的标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的过氧化氢。从而准确计算乳制品中过氧化氢酶的活力。2.操作简单，在测量乳制品过氧化氢酶活力中准确度提高20％左右，同时同一批次间稳定度大幅度提高，不需要绘制标准曲线，仅通过换算即可测出过氧化氢酶活力。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1选用某牧场两批次原料奶，分别为批次20161203和20161204，每一批次均分为4组，依次标记为C1、C2、C3、C4、D1、D2、D3、D4，其中C1、C2、D1和D2组使用本专利技术提供的方法进行过氧化氢酶活力测定，C3、C4、D3和D4组采用紫外法进行过氧化氢酶活力测定。实施例2C1、C2、D1和D2组按照以下步骤测定过氧化氢酶活力：第一步，取样，移取100ml待测牛奶C1放置入容器中，标记为A组；移取相同定量存放3个月灭菌牛奶放置入容器中，标记为B组；第二步，添加缓冲液，在A组中添加30ml按9:1配置的11.876g/L的磷酸氢二钠与9.078g/L的磷酸二氢钾混合溶液并充分搅拌，并静置；在B组中添加30ml按9:1配置的11.876g/L的磷酸氢二钠与9.078g/L的磷酸二氢钾混合溶液并充分搅拌，并静置；第三步，添加过氧化氢，在A组中添加200ul的30％浓度过氧化氢，在35℃环境下进行水浴加热60min，期间每20min搅拌一次；在B组中添加200ul的30％浓度过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种优质乳制品中过氧化氢酶活力的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：第一步，取样，移取定量待测牛奶放置入容器中，标记为A组；移取相同定量存放灭菌牛奶放置入容器中，标记为B组；第二步，添加缓冲液，在A组中添加缓冲液并充分搅拌，并静置；在B组中添加相同缓冲液并充分搅拌，并静置；第三步，添加过氧化氢，在A组中添加过氧化氢，并进行水浴加热；在B组中添加相同过氧化氢，并进行水浴加热；第四步，脂肪和蛋白质的沉淀，将乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液依次加入A组中，并进行过滤制得一号滤液；将相同量的乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液依次加入B组中，并进行过滤制得二号滤液；第五步，滴定，取定量一号滤液放入容器中依次添加离子水、浓度为50％硫酸水溶液，并混合均匀，使用高锰酸钾溶液进行滴定，记录高锰酸钾消耗量，标记为V1；取相同定量二号滤液放入容器中依次添加离子水、浓度为50％硫酸水溶液，并混合均匀，使用高锰酸钾溶液进行滴定，记录高锰酸钾消耗量，标记为V0；第六步，通过以下算式计算过氧化氢酶活力：X＝(V0‑V1)×C×D×(E/F)其中：X为待测牛奶过氧化氢酶活力(mgH2O2/100ml)；V0为B组高锰酸钾消耗量(ml)；V1为A组高锰酸钾消耗量(ml)；C为高锰酸钾浓度(mol/L)；D为消耗1ml的C浓度高锰酸钾对应的双氧水的质量(mg)；E为第五步中取定量滤液体积(ml)；F为第五步中添加离子水体积(ml)。...

【技术特征摘要】
1.一种优质乳制品中过氧化氢酶活力的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：第一步，取样，移取定量待测牛奶放置入容器中，标记为A组；移取相同定量存放灭菌牛奶放置入容器中，标记为B组；第二步，添加缓冲液，在A组中添加缓冲液并充分搅拌，并静置；在B组中添加相同缓冲液并充分搅拌，并静置；第三步，添加过氧化氢，在A组中添加过氧化氢，并进行水浴加热；在B组中添加相同过氧化氢，并进行水浴加热；第四步，脂肪和蛋白质的沉淀，将乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液依次加入A组中，并进行过滤制得一号滤液；将相同量的乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液依次加入B组中，并进行过滤制得二号滤液；第五步，滴定，取定量一号滤液放入容器中依次添加离子水、浓度为50％硫酸水溶液，并混合均匀，使用高锰酸钾溶液进行滴定，记录高锰酸钾消耗量，标记为V1；取相同定量二号滤液放入容器中依次添加离子水、浓度为50％硫酸水溶液，并混合均匀，使用高锰酸钾溶液进行滴定，记录高锰酸钾消耗量，标记为V0；第六步，通过以下算式计算过氧化氢酶活力：X＝(V0-V1)×C×D×(E/F)其中：X为待测牛奶过氧化氢酶活力(mgH2O2/100ml)；V0为B组高锰酸钾消耗量(ml)；V1为A组高锰酸钾消耗量(ml)；C为高锰酸钾浓度(mol/L)；D为消耗1ml的C浓度高锰酸钾对应的双氧水的质量(mg)；E为第五步中取定量滤液体积(ml)；F为第五步中添加离子水体积(ml)。2.根据权利要求1所述的一种优质乳制品中过氧化氢酶活力的测定方法，其特征在于：所述第一步，移取100ml待测牛奶...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱成林，刘虎传，谭莲英，马维，杨洋，高航，付永猛，岳春生，林永裕，夏忠悅，宋艳梅，刘海燕，
申请(专利权)人：昆明雪兰牛奶有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53