用于条形编码核酸以用于测序的方法和组合物技术

用于使用随机条形码标记样品中的核酸的方法和组合物，所述方法和组合物使用具有通用引发位点和靶标特异性区域的可延伸寡核苷酸。一些实施例涉及用于通过鉴定T细胞的所述TCRα链或β链来表征样品的方法和组合物。

Methods and compositions for the coding of nucleic acids for sequencing

Methods and compositions for marking nucleic acids in samples using random bar codes, the methods and compositions using extended oligonucleotides having universal priming sites and target specific regions. Some embodiments relate to methods and compositions for characterizing samples by identifying TCR alpha chains or beta strands of T cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于条形编码核酸以用于测序的方法和组合物相关申请本申请基于以下临时专利申请并且根据35U.S.C.§119(e)要求以下临时专利申请的权益：2015年2月27日提交的美国临时专利申请序列号62/126,397；2015年3月5日提交的美国临时专利申请序列号62/128,849；2015年5月13日提交的美国临时专利申请序列号62/160,976；2015年6月10日提交的美国临时专利申请序列号62/173,899；以及2015年7月17日提交的美国临时专利申请序列号62/194,075。这些相关申请的内容出于所有目的通过引用以其整体结合在此。参考序列表本申请连同以电子格式的序列表一起提交。序列表呈大小为77.3Kb的2016年2月25日创建的名称为BDCRI-011WO_SEQLISTING.TXT的文档提供。电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体结合在此。领域在此提供的实施例涉及用于使用随机条形码标记样品中的核酸的方法和组合物。一些实施例涉及用于通过鉴定T细胞的TCRα链或β链来表征样品的方法和组合物。背景已开发出用于标记核酸分子以用于扩增或测序的方法和组合物。对核酸靶标进行随机计数是重要的定量方法。然而，先前工作的缺点是设计用于特定靶标的试剂要设计用于随机标记将是昂贵的。在此描述了用于标记靶标以用于随机计数的方法和组合物。概述在一个方面中，本披露提供了标记样品中的核酸的方法，这些方法包括：将靶标与包含通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；将所述第二核苷酸序列与包含用于第一扩增引物的结合位点和通用衔接序列的第三寡核苷酸杂交，其中第一寡核苷酸和第三寡核苷酸中的一个或两个包含随机条形码的部分；延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；并且使用第一扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列以生成多个第四核苷酸序列，其中多个第四核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和随机条形码。在一些实施例中，样品是单细胞。在一些实施例中，靶标是mRNA分子。在一些实施例中，mRNA分子编码T细胞受体(TCR)α链或β链。在一些实施例中，靶标特异性序列特异性地结合到TCRα链或β链的C区上。在一些实施例中，方法包括使用第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列。在一些实施例中，第二扩增引物特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCRα链或β链的V区、TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，第二寡核苷酸特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCRα链或β链的V区、TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，第二寡核苷酸包含用于第二扩增引物的结合位点。在一些实施例中，方法包括使用第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列。在一些实施例中，第一寡核苷酸包含随机条形码。在一些实施例中，第三寡核苷酸包含随机条形码。在一些实施例中，第一寡核苷酸和第三寡核苷酸中的每一个包含随机条形码的部分。在一些实施例中，随机条形码包含分子标记。在一些实施例中，随机条形码包含通用标记、维标记、细胞标记、或其组合。在一些实施例中，第一寡核苷酸或第三寡核苷酸被连接到固体支持物上。在一些实施例中，样品包含多种靶标。在一些实施例中，多种靶标中的每一种用不同随机条形码标记。在一些实施例中，方法包括通过计数与靶标相缔合的不同随机条形码来计数多种靶标的数目。在一个方面中，本披露提供了标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，这些方法包括：将所述靶标与包含第一通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与包含第二通用衔接序列和第二靶标特异性序列的第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；将所述第二核苷酸序列与包含用于第一扩增引物的结合位点和第一通用衔接序列的第三寡核苷酸杂交；延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；将所述第三核苷酸序列与包含用于第二扩增引物的结合位点和第二通用衔接序列的第四寡核苷酸杂交，其中第三寡核苷酸和第四寡核苷酸中的一个或两个包含随机条形码的部分；延伸所述第四寡核苷酸以生成第四核苷酸序列；并且使用第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述第四核苷酸序列以生成多个第五核苷酸序列，其中多个第五核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和随机条形码。在一些实施例中，样品是单细胞。在一些实施例中，靶标是mRNA分子。在一些实施例中，mRNA分子编码T细胞受体(TCR)α链或β链。在一些实施例中，靶标特异性序列特异性地结合到TCRα链或β链的C区上。在一些实施例中，第二靶标特异性序列特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCRα链或β链的V区、TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，第三寡核苷酸包含随机条形码。在一些实施例中，第四寡核苷酸包含随机条形码。在一些实施例中，第三寡核苷酸和第四寡核苷酸中的每一个包含随机条形码的部分。在一些实施例中，随机条形码包含分子标记。在一些实施例中，随机条形码包含通用标记、维标记、细胞标记、或其组合。在一个方面中，本披露提供了标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，这些方法包括：将所述靶标与包含靶标特异性序列和用于第一扩增引物的结合位点的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与包含通用衔接序列和第二靶标特异性序列的第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；将所述第二核苷酸序列与第三寡核苷酸杂交，该第三寡核苷酸包含用于第二扩增引物的结合位点和特异性地结合通用衔接序列的序列，其中第二寡核苷酸和第三寡核苷酸中的一个或两个包含随机条形码的部分；延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；并且使用第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列以生成多个第四核苷酸序列，其中多个第四核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和随机条形码。在一些实施例中，样品是单细胞。在一些实施例中，靶标是mRNA分子。在一些实施例中，mRNA分子编码T细胞受体(TCR)α链或β链。在一些实施例中，靶标特异性序列特异性地结合到TCRα链或β链的C区上。在一些实施例中，第二靶标特异性序列特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCRα链或β链的V区、TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，第三寡核苷酸包含随机条形码。在一些实施例中，随机条形码包含分子标记。在一些实施例中，随机条形码包含通用标记、维标记、细胞标记、或其组合。在一个方面中，本披露提供了标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，这些方法包括：在包含通用衔接序列的第二寡核苷酸存在下，将所述靶标与包含靶标特异性序列和第一扩增引物序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成包含通用衔接序列补体的第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与第三寡核苷酸杂交，该第三寡核苷酸包含通用衔接序列、随机条形码以及用于第二扩增引物的结合位点；延伸所述第三寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；并且使用第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述第二核苷酸序列以生成多个第三核苷酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种标记样品中的核酸的方法，所述方法包括：将靶标与包含通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；将所述第二核苷酸序列与包含用于第一扩增引物的结合位点和所述通用衔接序列的第三寡核苷酸杂交，其中所述第一寡核苷酸和所述第三寡核苷酸中的一个或两个包含随机条形码的部分；延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；并且使用第一扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列以生成多个第四核苷酸序列，其中所述多个所述第四核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和所述随机条形码。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.27 US 62/126,397;2015.03.05 US 62/128,849;1.一种标记样品中的核酸的方法，所述方法包括：将靶标与包含通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；将所述第二核苷酸序列与包含用于第一扩增引物的结合位点和所述通用衔接序列的第三寡核苷酸杂交，其中所述第一寡核苷酸和所述第三寡核苷酸中的一个或两个包含随机条形码的部分；延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；并且使用第一扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列以生成多个第四核苷酸序列，其中所述多个所述第四核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和所述随机条形码。2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是单细胞。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述靶标是mRNA分子。4.如权利要求3所述的方法，其中所述mRNA分子编码T细胞受体(TCR)α链或β链。5.如权利要求4所述的方法，其中所述靶标特异性序列特异性地结合到所述TCRα链或β链的C区上。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，包括使用第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列。7.如权利要求6所述的方法，其中所述第二扩增引物特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCRα链或β链的V区、TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCRα链或β链的V区、TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸包含用于第二扩增引物的结合位点。10.如权利要求9所述的方法，包括使用所述第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列。11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含所述随机条形码。12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第三寡核苷酸包含所述随机条形码。13.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸和所述第三寡核苷酸中的每一个包含所述随机条形码的部分。14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述随机条形码包含分子标记。15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述随机条形码包含通用标记、维标记、细胞标记、或其组合。16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸或所述第三寡核苷酸被连接到固体支持物上。17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述样品包含多种所述靶标。18.如权利要求17所述的方法，其中所述多种所述靶标中的每一种用不同随机条形码标记。19.如权利要求18所述的方法，包括通过计数与所述靶标相缔合的所述不同随机条形码来计数所述多种所述靶标的数目。20.一种标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，所述方法包括：将所述靶标与包含第一通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与包含第二通用衔接序列和第二靶标特异性序列的第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；将所述第二核苷酸序列与包含用于第一扩增引物的结合位点和所述第一通用衔接序列的第三寡核苷酸杂交；延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；将所述第三核苷酸序列与包含用于第二扩增引物的结合位点和所述第二通用衔接序列的第四寡核苷酸杂交，其中所述第三寡核苷酸和所述第四寡核苷酸中的一个或两个包含随机条形码的部分；延伸所述第四寡核苷酸以生成第四核苷酸序列；并且使用第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述第四核苷酸序列以生成多个第五核苷酸序列，其中所述多个所述第五核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和所述随机条形码。21.如权利要求20所述的方法，其中所述样品是单细胞。22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述靶标是mRNA分子。23.如权利要求22所述的方法，其中所述mRNA分子编码T细胞受体(TCR)α链或β链。24.如权利要求23所述的方法，其中所述靶标特异性序列特异性地结合到所述TCRα链或β链的C区上。25.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述第二靶标特异性序列特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCRα链或β链的V区、TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。26.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述第三寡核苷酸包含所述随机条形码。27.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述第四寡核苷酸包含所述随机条形码。28.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述第三寡核苷酸和所述第四寡核苷酸中的每一个包含所述随机条形码的部分。29.如权利要求20-28中任一项所述的方法，其中所述随机条形码包含分子标记。30.如权利要求20-29中任一项所述的方法，其中所述随机条形码包含通用标记、维标记、细胞标记、或其组合。31.一种标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，所述方法包括：将所述靶标与包含靶标特异性序列和用于第一扩增引物的结合位点的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与包含通用衔接序列和第二靶标特异性序列的第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；将所述第二核苷酸序列与第三寡核苷酸杂交，所述第三寡核苷酸包含用于第二扩增引物的结合位点和特异性地结合所述通用衔接序列的序列，其中所述第二寡核苷酸和所述第三寡核苷酸中的一个或两个包含随机条形码的部分；延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；并且使用第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列以生成多个第四核苷酸序列，其中所述多个...

【专利技术属性】
技术研发人员：格伦·弗，朱莉·威廉米，玛丽亚·西姆比尔斯基，艾琳·夏姆，
申请(专利权)人：赛卢拉研究公司，
类型：发明
国别省市：美国,US