基于CRISPR的组合物和使用方法技术

本发明专利技术涉及用于CRISPR系统中的修饰的组合物和其使用方法。特别地，描述了crRNA和tracrRNA的长度修饰和化学修饰形式，用作与CRIPSR系统的Cas9相互作用的重构的向导RNA。所得crRNA和tracrRNA的长度修饰和化学修饰形式可经济地生产，并且可以剪裁以具有与其在CRIPSR Cas9核酸内切酶系统背景中的生物化学和生物活性相关的独特性质。

CRISPR based compositions and methods of use

The present invention relates to compositions modified for use in CRISPR systems and methods of use thereof. In particular, the length modification and chemical modification forms of crRNA and tracrRNA are used as the reconfiguration wizard for Cas9 interaction with the CRIPSR system, RNA. And chemical modification of the form can be produced economically from crRNA and length of tracrRNA, and can be tailored to have it in CRIPSR Cas9 endonuclease system background in biochemistry and biological activity related to the unique nature of.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于CRISPR的组合物和使用方法相关申请的交叉引用本申请依据35U.S.C.119要求2014年12月18日和2015年10月9日提交并且名称为“基于CRISPR的组合物和使用方法(CRISPR-BASEDCOMPOSITIONSANDMETHODSOFUSE)”的美国临时专利申请序列号62/093,588和62/239,546的优先权，所述临时专利申请的内容通过引用整体并入本文。序列表本申请包含序列表，其已经通过EFS-Web以ASCII格式提交并且通过引用整体并入本文。ASCII拷贝创建于2015年12月18日，命名为IDT01-008-US_ST25.txt，并且大小为177,163字节。
本专利技术涉及用于CRISPR系统中的修饰的组合物，和其使用方法。
技术介绍
使用成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和相关的Cas蛋白(CRISPR-Cas系统)进行位点特异性DNA切割对于许多生物学应用显示出巨大的潜力。CRISPR被用于基因组编辑；转录阻遏因子(CRISPRi)和激活因子(CRISPRa)的基因组规模特异性靶向内源基因；以及利用Cas酶的RNA向导DNA靶向的其它应用。CRISPR-Cas系统产生自细菌和古细菌，以提供针对病毒和质粒的适应性免疫。有三类可能潜在适用于研究和治疗性试剂的CRISPR-Cas系统，但是II型CRISPR系统在具有具有理想特征，利用单一CRISPR相关(Cas)核酸酶(特别是Cas9)与适当的向导RNA的复合物(与包含CRISPR激活RNA:反式激活crRNA(crRNA:tracrRNA)对的细菌中的天然复合物类似的2部分RNA系统或人工嵌合单向导RNA(sgRNA))介导目标DNA的双链切割。在哺乳动物系统中，已通过在体外转录后转染含有驱动RNA转录的RNAPolIII启动子(例如U6或H1)、病毒载体和单链RNA的DNA盒，引入了这些RNA(参见Xu,T.等,《应用与环境微生物学(ApplEnvironMicrobiol)》,2014.80(5):第1544-52页)。在CRISPR-Cas9系统中，使用例如以化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)中存在的系统为例(S.py.或Spy)，天然crRNA长度为约42bp，含有与目标序列(也称为前间区序列(protospacer))互补的约20个碱基的5'区和通常约22个碱基长度的对应于tracrRNA序列的互补区的3'区。天然tracrRNA长度为约85-90个碱基，具有含有与crRNA互补的区域的5'区以及5'上游的约10个碱基区。tracrRNA的其余3'区包括二级结构(在本文中称为“tracrRNA3'尾”)。Jinek等广泛研究了CRISPR-Cas9系统正常运作所需的crRNA和tracrRNA的部分(《科学(Science)》,2012.337(6096):第816-21页)。他们设计了仍可在CRISPR-Cas9中起作用的截短的crRNA:tracrRNA片段，其中crRNA是野生型42个核苷酸并且tracrRNA被截短到75个核苷酸。他们还开发了一种实施方案，其中crRNA和tracrRNA利用接头环连接，形成单向导RNA(sgRNA)，其在不同的实施方案中在99-123个核苷酸之间变化。天然的2部分crRNA:tracrRNA复合物的构型示于图1中，并且人工sgRNA单向导的99个核苷酸实施方案示于图2中。至少两个团队已经阐明了化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9(SpyCas9)的晶体结构。在Jinek,M.等中，该结构没有显示与向导RNA或目标DNA复合的核酸酶。他们进行了分子模拟实验，以揭示复合物形式的蛋白质与RNA和DNA之间的预测的相互作用(《科学(Science)》,2014.343,第1215页,DOI:10.1126/science/1247997)。在Nishimasu,H.等中，SpyCas9的晶体结构在2.5埃分辨率下显示为与sgRNA和其目标DNA的复合物(《细胞(Cell)》,2014.156(5):第935-49页，整体并入本文)。晶体结构鉴定了Cas9酶的两个叶：识别叶(REC)和核酸酶叶(NUC)。sgRNA:目标DNA异源双链体(带负电荷)位于两个叶之间的带正电荷的沟槽中。显示与已知蛋白质无结构相似性且因此可能是Cas9特异性功能结构域的REC叶与彼此互补的crRNA和tracrRNA的部分相互作用。另一个团队Briner等(《分子细胞(MolCell)》,2014.56(2):第333-9页，整体并入本文)鉴定并表征了天然crRNA:tracrRNA双链体和sgRNA内的六个保守组件。CRISPR-Cas9系统用于基因组工程，如下：crRNA的一部分与目标序列杂交，tracrRNA的一部分与crRNA的一部分杂交，并且Cas9核酸酶与整个构建体结合并引导切割。Cas9含有与核酸内切酶HNH和RuvC同源的两个结构域，其中HNH结构域切割与crRNA互补的DNA链，并且RuvC样结构域切割非互补链。这导致基因组DNA中的双链断裂。当通过非同源末端连接(NHEJ)修复时，断裂通常偏移1个或更多个碱基，导致天然DNA序列的破坏，并且在许多情况下，如果该事件发生在蛋白质编码基因的编码外显子中，则导致移码突变。断裂也可以通过同源依赖性重组(HDR)修复，这允许经由实验操作将新的遗传物质插入到由Cas9切割产生的切割位点中。用于将向导RNA递送到哺乳动物细胞中的一些当前方法包括转染含有用于内源转录的RNAPolIII启动子的双链DNA(dsDNA)，病毒递送，转染作为体外转录(IVT)产物的RNA，或显微注射IVT产物。这些方法中的每一种都有缺点。已知引入哺乳动物细胞中的未经修饰的外源RNA通过Toll样受体(TLR)、RIG-I、OASI和识别病原体相关分子模式(PAMP)的其它受体的识别启动先天免疫应答。然而，在大多数已公布的研究中，将通过T7RNA聚合酶体外转录(IVT)的RNA递送至细胞。这种类型的RNA有效载荷(payload)已被证明是先天免疫应答的触发因子。上述替代性递送方法也各自具有其自身缺点。例如，dsDNA盒可以导致整合，由RNAPolII启动子内源驱动的向导RNA转录可以组成性地持续存在，并且所转录的RNA量是不可控制的。RNA由血清和细胞中存在的核酸酶快速降解。通过IVT方法或化学合成制备的未经修饰的CRISPRRNA触发因子(crRNA、tracrRNA和sgRNA)在递送至哺乳动物细胞期间或递送之后迅速降解。如果RNA被化学修饰以获得核酸酶抗性，则将实现更大的活性。血清和细胞中存在的最有效的降解活性是3'-核酸外切酶(Eder等，《反义研究和开发(AntisenseResearchandDevelopment)》,1:141-151,1991)。因此，对合成寡核苷酸进行“封端”通常改进核酸酶稳定性。单链反义寡核苷酸(ASO)和双链小干扰RNA(siRNA)的化学修饰已经得到充分研究，并且如今实践中有成功的方法(关于综述，参见：Kurreck,《欧洲生物化学杂志(Eu本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的tracrRNA，其包含SEQ ID NO.:18的长度修饰形式，其中所述分离的tracrRNA在成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)‑CRISPR相关(Cas)(CRISPR‑Cas)核酸内切酶系统中显示活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.18 US 62/093,588;2015.10.09 US 62/239,5461.一种分离的tracrRNA，其包含SEQIDNO.:18的长度修饰形式，其中所述分离的tracrRNA在成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)核酸内切酶系统中显示活性。2.根据权利要求1所述的分离的tracrRNA，其中所述SEQIDNO.:18的长度修饰形式由SEQIDNO.:18的缩短形式组成。3.根据权利要求2所述的分离的tracrRNA，其中所述SEQIDNO.:18的缩短形式由选自以下的成员组成：缺失5’末端1至20个核苷酸的SEQIDNO.:18；缺失3’末端1至10个核苷酸的SEQIDNO.:18；缺失5’末端1至20个核苷酸并且缺失3’末端1至10个核苷酸的SEQIDNO.:18。4.根据权利要求2所述的分离的tracrRNA，其中所述SEQIDNO.:18的缩短形式由选自SEQIDNO.:2、30-33和36-39的成员组成。5.根据权利要求2所述的分离的tracrRNA，其中所述SEQIDNO.:18的缩短形式由SEQIDNO.:2或38组成。6.根据权利要求1所述的分离的tracrRNA，其进一步包含至少一个化学修饰的核苷酸。7.一种分离的crRNA，其包含式(I)的长度修饰形式：5'-X—Z-3'(I)，其中X表示包含靶特异性前间区序列结构域的序列，并且Z表示包含tracrRNA结合结构域的序列，所述前间区序列结构域包含约20个通用核苷酸，所述tracrRNA结合结构域包含约20个核苷酸。其中所述分离的crRNA在成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)核酸内切酶系统中显示活性。8.根据权利要求7所述的分离的crRNA，其中所述式(I)的长度修饰形式由式(I)的缩短形式组成。9.根据权利要求8所述的分离的crRNA，其中所述式(I)的缩短形式由选自以下的成员组成：缺失Z结构域的3’末端1至8个核苷酸的式(I)；和缺失X结构域的5’末端核苷酸以容纳具有17、18、19或20个核苷酸的靶特异性前间区序列结构域的式(I)。10.根据权利要求7所述的分离的crRNA，其进一步包含至少一个化学修饰的核苷酸。11.根据权利要求10所述的分离的crRNA，其中所述式(I)的长度修饰形式由SEQIDNO.:429-439组成。12.一种分离的tracrRNA，其包含SEQIDNO.:2、18、30-33和36-39之一的化学修饰形式，其中所述分离的tracrRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·A·科林伍德，A·M·雅各比，G·R·雷蒂希，M·S·舒伯特，M·A·贝尔克，
申请(专利权)人：综合基因技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US