用于治疗和预防炎症的组合物和方法技术

本发明专利技术提供用于通过抑制NRP1依赖性细胞信号传导(i)治疗或预防炎症；和(ii)预防或降低先天免疫反应超活化的新型化合物组合物和方法。还提供了特异性抑制SEMA3A介导的细胞信号传导的化合物、组合物、和方法。

Compositions and methods for the treatment and prevention of inflammation

The present invention provides novel compounds, compositions, and methods for preventing or reducing the activation of innate immune responses by inhibiting NRP1 dependent cell signaling (I) treatment or preventing inflammation; and (II). Compounds, compositions, methods, and methods for specifically inhibiting SEMA3A mediated cell signaling are also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗和预防炎症的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求2014年9月5日提交的美国临时申请序列号US62/046,459的优先权，其通过引用其全部内容而并入于此。序列表本申请包含计算机可读形式的序列表，标题为“12810_513_ST25”，创建于2015年9月8日，大小为580K字节。计算机可读形式通过引用并入本文。关于联邦政府资助研究或开发的声明不适用。专利
本专利技术涉及炎症。更具体地，本专利技术涉及抑制NRP1途径用于预防或治疗炎症。参考序列表不适用专利技术背景局部急性炎症反应主要是有益的，并且构成机体抵抗宿主感染的第一道防线。相反，急性全身性炎症如感染性休克是发病和死亡的主要原因(58)。当慢性、低级别炎症持续时，其可以是几种全身性疾病——范围为II型糖尿病、关节炎、癌症、多种神经炎性状况等——的根源。在所有细胞因子、受体和被认为有助于炎性过程的其它参与者中，一个已被大大忽略的范例是经典神经元导向因子(neuronalguidancecue)及其受体的影响。这些包括脑信号蛋白(semaphorin)3A(SEMA3A，例如mRNA：NM_006080；和蛋白质：NP_006071和图21)及其受体神经毡蛋白-1(NRP1，例如mRNA：NM_001024628；和蛋白质：NP_001019799，NM_003873和图22(同种型2或b，分泌的)和26(同种型1)。NRP1在淋巴和骨髓细胞上表达(59,31)。然而其在炎症中的作用在很大程度上是未知的，特别是在细胞因子产生的情况下。脑信号蛋白最初被表征为胚胎形成期间轴突导向(axonalguidance)中的关键参与者。现在清楚的是，脑信号蛋白的作用延伸超过轴突导向并影响血管系统、肿瘤生长和免疫应答。脑信号蛋白家族总数至少21个脊椎动物基因和8个额外的无脊椎动物中的基因。所有脑信号蛋白都含有用于发信号所需的～500个氨基酸SEMA结构域。3型(class3)脑信号蛋白(如SEMA3A)是家族中唯一的分泌成员。SEMA3A作为二硫键连接的同型二聚体而被合成，而二聚化对于发信号是必需的。在神经元中，SEMA3A与其同源受体(cognatereceptor，关联受体)神经毡蛋白-1(NRP1)的结合通过丛蛋白(plexin)引起细胞骨架塌陷(60)；内皮细胞中的转导机制仍然不清楚。NRP1具有通过其胞外结构域上的不同位位点结合两种结构不同的配体的特定能力(27-29)。它不仅结合引起细胞骨架塌陷的SEMA3A(46,47)，而且结合增强与VEGFR2的结合的VEGF165(28、29、47、61)并因此增加其血管生成潜力(62)。晶体学证据揭示VEGF165和SEMA3A不直接竞争NRP1，而是可以同时与NRP1在不同的、非重叠的位点结合(63)。此外，遗传研究表明NRP1明确调节VEGF和SEMA3A对神经元和血管发展的作用(64)。最后，还发现NRP1与TGF-β1结合并调节其潜伏形式。NRP1是具有被细分为3个亚结构域(a1a2、b1b2和c)的大的860个氨基酸胞外结构域和短的40个氨基酸的胞内结构域(65)的单穿(single-pass，单通)跨膜受体。在神经元中，SEMA3A与NRP1的结合募集转导其胞内信号的丛蛋白(60)并引起细胞骨架塌陷。内皮细胞中的转导机制仍然不清楚。NRP1主要经由其a1a2(但也可能是b1-)结构域(引发细胞骨架塌陷)结合SEMA3A(46,47)和通过其b1b2结构域(增强与VEGFR2的结合)结合VEGF165(28,29,47,61)并因此增加其血管发生潜力(62)。因此，缺血性视网膜中SEMA3A的水平升高可通过使前进中的尖端细胞塌陷并使其脱离排斥指示(repellentcue)的来源而参与迫使新血管进入玻璃体(21)。CNS长期以来被认为是免疫特权系统，但现在清楚的是，脑、视网膜和脊髓经历复杂的免疫监视(1，2)。CNS中的免疫活性主要依赖于先天免疫应答，并且在健康时存在而在疾病诸如糖尿病性视网膜病变、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化和阿尔茨海默病中升高。这在视网膜中是明显的，其中强化的、主要是基于小胶质细胞/巨噬细胞的免疫应答与若干视力威胁性疾病如糖尿病性视网膜病变(DR)(3-5)、年龄相关性黄斑变性(AMD)(6-8)和早产儿视网膜病变(ROP)(9,10)的发展相关。综上，这些视网膜疾病是造成工业化国家中失明的主要原因(6,11,12)。许多炎性疾病和状况的当前治疗路线具有重大的副作用和缺乏的长期安全性。因此，仍然需要新颖的药物靶和治疗方法。本说明书涉及多个文献，其内容通过引用整体并入本文。
技术实现思路
本专利技术人寻求确定骨髓驻留型(myeloid-resident，骨髓固有的)NRP1(骨髓-驻留型NRP1)在先天免疫反应的情况下的功能。本专利技术人已经确定SEMA3A、VEGF和TGF-β充当表达NRP1受体的单核吞噬细胞(MP，例如，小胶质细胞和巨噬细胞)的有效引诱剂。显示在涉及包括增殖性视网膜病变、感染性休克和脑缺血/中风的先天免疫反应的超活化的各种状况下，先天免疫细胞中NRP1发信号的抑制导致保护免于MP依赖的炎症和组织损伤。此外，本专利技术人已经设计各种可溶性NRP1衍生的陷阱(trap)，其抑制SEMA3A发信号并显示SEMA3A的抑制显著地降低各种状况中的炎症反应。因此，本专利技术涉及NRP1细胞信号转导(例如，NRP1和其配体)的抑制用以预防或治疗涉及先天免疫反应超活化(即，病理性活化)的炎性疾病和状况。此类疾病和状况的非限制性实例包含败血症、中风、脑缺血、和各种增殖性视网膜病变。更具体地，在一方面，本专利技术涉及治疗或预防炎症的方法，其包括抑制NRP1依赖性细胞信号传导。在另一方面，本专利技术涉及预防或降低先天免疫反应超活化的方法，包括抑制NRP1依赖性细胞信号传导。在一个实施方式中，先天免疫反应超活化包括i)IL-1β和TNFα的分泌和/或单核吞噬细胞(MP)的活化/募集。在一个实施方式中，抑制NRP1依赖性细胞信号传导包括：a)降低NRP1表达或活性；和/或b)降低NRP1配体表达或活性。在一个实施方式中，NRP1配体是SEMA3A、VEGF165或TGF-β。在具体实施方式中，NRP1配体是SEMA3A。在一个实施方式中，降低NRP1活性包括抑制NRP1与至少一种NRP1配体的结合。在一个实施方式中，抑制NRP1与至少一种NRP1配体的结合包括施用NRP1抗体(例如，SEMA3A抗体)。在以上方法的另一实施方式中，降低NRP1活性包括施用有效量的NRP1陷阱，其包含可溶性NRP1多肽或其功能片段。在具体实施方式中，NRP1陷阱如图19或20所示。在具体实施方式中，本专利技术的NRP1陷阱抑制SEMA3A与NPR-1结合但基本上不抑制VEGF与NRP1结合。在一个实施方式中，这样的NRP1陷阱包括NRP1的a1a2结构域但不包含NRP1的b1和/或b2亚域(一个或多个)。在另一实施方式中，这样的陷阱包括在对应于如图22中所示的NRP1氨基酸序列的酪氨酸297的位置处结构域b1中的突变，其降低或消除VEGF与陷阱结合。在具体的实施方式中，突变将位置297处的酪氨酸变为丙氨酸。在具体的实施方式中本文档来自技高网...

【技术保护点】
治疗或预防炎症的方法，其包括在受试者中抑制NRP1依赖性细胞信号传导。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.05 US 62/046,4591.治疗或预防炎症的方法，其包括在受试者中抑制NRP1依赖性细胞信号传导。2.预防或降低先天免疫反应超活化的方法，其包括在受试者中抑制NRP1依赖性细胞信号传导。3.权利要求2所述的方法，其中所述先天免疫反应超活化包括i)IL-6、IL-1β和TNFα的分泌和/或单核吞噬细胞(MP)的募集。4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中抑制NRP1依赖性细胞信号传导包括：(a)降低NRP1表达或活性；和/或(b)降低NRP1配体表达或活性；其中所述NRP1配体是SEMA3A、VEGF和/或TGF-β。5.权利要求4所述的方法，其中所述方法包括(i)通过抑制NRP1与至少一种NRP1配体的结合降低NRP1活性。6.权利要求5所述的方法，其中所述NRP1配体是SEMA3A、VEGF或TGF-β。7.权利要求5或6所述的方法，其中抑制NRP1与至少一种NRP1配体的结合包括施用抗NRP1抗体或NRP1陷阱，其中所述陷阱包含NRP1多肽或其功能片段或变体。8.权利要求7所述的方法，其中所述NRP1多肽对应于可溶性NRP1同种型2。9.权利要求8所述的方法，其中所述可溶性NRP1同种型2包括具有如图22中所示的氨基酸序列的多肽或基本上由具有如图22中所示的氨基酸序列的多肽组成，而无信号肽。10.权利要求7所述的方法，其中所述NRP1多肽对应于所述NRP1同种型1多肽的胞外结构域。11.权利要求10所述的方法，其中所述NRP1同种型1多肽如图26中所示并且其中所述胞外结构域包含图26中显示的所述NRP1多肽的氨基酸22至859(SEQIDNO：66的残基22至859)。12.权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述NRP1陷阱包括NRP1多肽，其包括(i)如SEQIDNO：65中所示的NRP1多肽的氨基酸22至609；(ii)如SEQIDNO：66中所示的NRP1多肽的氨基酸22至859；(iii)如SEQIDNO：69中所示的NRP1多肽的氨基酸22至859(iv)或(i)、(ii)或(iii)的功能片段或功能变体。13.权利要求7至12中任一项所述的方法，其中所述抗NRP1抗体抑制SEMA3A与NPR-1的结合但基本上不抑制VEGF与NRP1的结合，并且其中所述NRP1陷阱与SEMA3A结合但基本上不与VEGF165结合或具有与SEMA3A结合亲和力相比降低的对VEGF165的结合亲和力。14.权利要求13所述的方法，其中所述NRP1陷阱(i)完全或部分地缺少NRP1的结构域b1和/或b2；或(ii)包括抑制VEGF与NRP1结合的至少一个氨基酸点突变。15.权利要求13所述的方法，其中所述抗NRP1抗体不与NRP1的结构域b1和/或b2结合。16.权利要求14所述的方法，其中所述点突变包括(a)在对应于图22或图26中所示的NRP1氨基酸序列的酪氨酸297的氨基酸残基处的结构域b1的氨基酸取代或缺失；(b)在对应于图22或图26中所示的NRP1氨基酸序列的天冬氨酸320的氨基酸残基处的结构域b1中的氨基酸取代或缺失；和/或(c)在对应于图22或图26中所示的NRP1氨基酸序列的谷氨酸319的氨基酸残基处的结构域b1中的氨基酸取代或缺失。17.权利要求16所述的方法，其中所述点突变是Y297A取代；D320K取代和/或E319K取代。18.权利要求7至12中任一项所述的方法，其中所述NRP1陷阱：(a)包含所述NRP1多肽的结构域a1、a2、b1、b2、和c；(b)包含所述NRP1多肽的结构域a1、a2、b1和b2；(c)包含所述NRP1多肽的结构域a1、a2、和b1；(d)包含所述NRP1多肽的结构域a1和a2；(e)包含所述NRP1多肽的结构域b1，其中所述结构域b1包括在对应于包含如图26中所示的氨基酸序列的NRP1多肽的(i)酪氨酸297；(ii)天冬氨酸320和/或(iii)谷氨酸319的氨基酸残基处的至少一个点突变，其中所述至少一个突变降低或消除与VEGF165的结合；(f)完全或部分地缺少所述NRP1多肽的结构域c；(g)完全或部分地缺少所述NRP1多肽的结构域b1；(h)完全或部分地缺少所述NRP1多肽的结构域b2；(i)缺少所述NRP1多肽的结构域b1和b2；或(j)缺少所述NRP1多肽的结构域b1、b2和c。19.权利要求18所述的方法，其中(i)所述结构域a1包括对应于如图26中所示的NRP1多肽的氨基酸27至141的氨基酸序列或基本上由对应于如图26中所示的NRP1多肽的氨基酸27至141的氨基酸序列组成；(ii)所述结构域a2包括对应于如图26中所示的NRP1多肽的氨基酸147至265的氨基酸序列；(iii)所述结构域b1包括对应于如图26中所示的NRP1多肽的氨基酸275至424的氨基酸序列；(iv)所述结构域b2包括对应于如图26中所示的NRP1多肽的氨基酸431至583的氨基酸序列；和/或(v)所述结构域c结构域包括对应于如图26中所示的NRP1多肽的氨基酸645至811的氨基酸序列。20.权利要求18所述的方法，其中(i)所述结构域a1包括对应于如图26中所示的NRP1多肽的氨基酸22至148的氨基酸序列或基本上由对应于如图26中所示的NRP1多肽的氨基酸22至148的氨基酸序列组成；(ii)所述结构域a2包括对应于如图26中所示的NRP1多肽的氨基酸149至275的氨基酸序列；(iii)所述结构域b1包含对应于如图26中所示的NRP1多肽的氨基酸276至428的氨基酸序列；(iv)所述结构域b2包含对应于如图26中所示的NRP1多肽的氨基酸429至589的氨基酸序列；和/或(v)所述结构域c结构域包含对应于如图26中所示的NRP1多肽的氨基酸590至859的氨基酸序列。21.权利要求7所述的方法，其中所述方法包括通过施用基本上由如表1中所示的陷阱或其功能变体组成的NRP1陷阱来抑制所述NRP1与至少一种NRP1配体的结合。22.权利要求7至20中任一项所述的方法，其中所述NRP1陷阱进一步包括蛋白质纯化结构域。23.权利要求22所述的方法，其中所述纯化结构域是聚组氨酸标签。24.权利要求7至20中任一项所述的方法，其中所述NRP1陷阱进一步包括FC结构域。25.权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述NRP1陷阱包括能够使所述蛋白质纯化结构域或FC结构域从所述NRP1陷阱移除的蛋白酶或肽酶切割位点。26.权利要求25所述的方法，其中所述蛋白酶或肽酶是TEV蛋白酶切割位点。27.权利要求26所述的方法，其中所述TEV蛋白酶切割位点包括氨基酸序列GSKENLYFQG。28.权利要求4所述的方法，其中所述方法包括降低NRP1配体表达或活性，和其中所述NRP1配体是SEMA3A。29.权利要求28所述的方法，包括通过施用抗SEMA3A抗体来抑制SEMA3A与NRP1的结合而降低SEMA3A活性，所述抗SEMA3A抗体与SEMA3A的SEMA结构域结合。30.权利要求4所述的方法，其中所述方法包括通过施用NRP1反义、shRNA或siRNA降低NRP1表达。31.权利要求4所述的方法，其中所述方法包括通过施用SEMA3A反义、shRNA或siRNA降低SEMA3A表达。32.NRP1多肽陷阱，其包含与SEMA3A、VEGF165和/或TGF-β结合的NRP1多肽或其功能片段或变体。33.权利要求32所述的NRP1多肽陷阱，其中所述NRP1多肽对应于可溶性NRP1同种型2。34.权利要求33所述的NRP1多肽陷阱，其中所述可溶性NRP1同种型2包含具有如图22中所示的氨基酸序列的多肽或基本上由具有如图22中所示的氨基酸序列的多肽组成，无信号肽。35.权利要求34所述的NRP1多肽陷阱，其中所述NRP1多肽对应于所述NRP1同种型1多肽的胞外结构域。36.权利要求35所述的NRP1多肽陷阱，其中所述NRP1同种型1多肽如图26中所示并且其中所述胞外结构域对应于图26中显示的所述NPR1多肽的氨基酸22至859(SEQIDNO：66的残基22至859)。37.权利要求32至36中任一项所述的NRP1多肽陷阱，其中所述NRP1陷阱包括NRP1多肽，其包含(i)如SEQIDNO：65中所示的NRP1多肽的氨基酸22至609；(ii)如SEQIDNO：66中所示的NRP1多肽的氨基酸22至859；(iii)如SEQIDNO：69中所示的NRP1多肽的氨基酸22至8...

【专利技术属性】
技术研发人员：普热梅斯瓦夫·萨皮哈，诺曼德·比利，
申请(专利权)人：RSEM有限合伙公司，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA