用于体外和体内检测细菌和/或真菌的荧光多分枝探针制造技术

提供了一种探针，所述探针包括核心和多个探针元件；所述多个探针元件中的每个探针元件从核心延伸且包含荧光团和结合部分。还提供了该探针和包含该探针的试剂盒的使用方法。

Fluorescent branching probes for detection of bacteria and / or fungi in vitro and in vivo

A probe is provided that includes a core and a plurality of probe elements; each probe element in the plurality of probe elements extends from the core and comprises a fluorophore and a binding portion. The probe and the use of a kit comprising the probe are also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于体外和体内检测细菌和/或真菌的荧光多分枝探针专利
本专利技术涉及分子探针领域，更具体地涉及用于微生物诸如细菌和真菌检测的分子探针。专利技术背景在世界各地存在日益增加的细菌感染负担，且准确诊断仍然是提供准确治疗的基础。医院内和保健所的患者通常有细菌感染的风险。医院获得性感染(HAI)变得更加普遍，并且迅速准确地应对此类感染的能力变得越来越重要。当患者具有活跃且健康的免疫系统时，HAI所构成的危险被降低。然而，严重患病的患者的免疫系统往往至少部分受损，使患者特别容易受到HAI的伤害。重症监护的用呼吸机供氧的患者和特别是所有免疫受损的患者特别容易受到HAI的伤害，并且最具破坏性的HAI之一仍然是呼吸机相关性肺炎(VAP)。众所周知地，VAP仍然难以准确诊断，并且已经证明了不恰当的治疗对患者有害。因此，VAP具有高死亡率、高发病率并且仍然是医疗资源的负担。关于诊断，金标准仍然是肺活组织检查，其是侵入性的并且由于测试的内在侵入性性质而很少被使用的检查。其他方法诸如支气管肺泡灌洗(bronchoalveolarlavage)仍然存在争议，而非培养方法没有任何显著影响或稳健的验证。发烧、增加的氧依赖性和心动过速的临床征象仍然是检测炎症或急性肺损伤的非特异性手段，并且因此，需要允许准确且及时诊断VAP的可选择的方法，该方法将允许做出即时的医疗决定，并且以适当疗法改善患者的结局。目前，关于何时和是否开始抗生素治疗、选择使用的剂以及如果开始了治疗，何时逐步降级治疗，临床医师面对极大的不确定性。这些问题是有效的抗生素管理的障碍，因为延迟和不足的抗生素治疗与不良临床结果之间存在已被证明的关联。分子成像技术可以允许使用细菌特异性示踪剂，并且当与成像模态(modalities)诸如正电子发射断层扫描(PET)组合时，具有描绘无菌部位和感染部位的能力。然而，这种方法不适用于一些患者群体，诸如需要即时护理诊断测试的重症监护组，并且施用放射性剂可能造成困难或限制性的。这些还涉及辐射并且不容易应用于在医院设置以外成像。本领域中可选择的方法是应用光学探针，以允许通过使用内镜来使患者的靶区域直接可视化。属于VisenMedical,Inc.的WO2003/079015公开了用于鉴定和表征正常和关于改变的代谢活性的患病组织的光学成像探针。属于本申请人的WO2012/136958公开了当染料被特定细胞类型内化时，通过增加荧光来允许细胞在体内可视化的支化染料(brancheddye)。然而，仍存在对于改善的光学探针和成像方法的需求，该光学探针和成像方法将允许在原位、护理现场确定患者的状况是否由于感染引起，并且如果是，确定感染的病原体(causativeagent)。此外，仍存在对于改善的光学探针的需求，该光学探针在例如挑战性条件(challengingcondition)期间诸如在表面活性剂的存在下保留在靶细胞膜。因此，本专利技术的目的是提供适于快速且准确的现场护理诊断的改善的探针和成像方法，和提供由其靶更好地保留的光学探针。专利技术描述根据本专利技术的第一方面，提供了一种探针，所述探针包含核心和多个探针元件，所述多个探针元件中的每个探针元件从所述核心延伸并且包含荧光团和结合部分。在使用期间，本专利技术的探针通常被递送到靶区域并结合靶区域内的任何细菌。优选地，多个探针元件的每个的结合部分可用于结合细菌，并且因此，如果靶区域中存在细菌，探针通过多个探针元件的结合部分的每个或至少大部分结合细菌。本领域已知的光学探针通常在体内难以保留在靶区域中，其中挑战性条件可以引起探针的降解或氧化和/或蛋白酶分解，并且结果是，探针不能保持与它们的靶结合以允许可靠地检测靶。例如，用于肺内成像的光学探针，其中存在高表面活性剂浓度，通常不允许检测它们的靶。肺内的另外的挑战包括通过在其中的循环液体“洗去”探针。令人惊讶的是，专利技术人已经发现，与本领域已知的探针相比，本专利技术的探针对氧化、降解和蛋白酶活性更稳定，并且此类探针允许在体内甚至在挑战性条件诸如在肺中发现的条件下可靠地检测细菌。通过术语“核心”，我们指的是连接多个探针元件以形成单个单元的共同部分。因此，核心可以是单个原子或包含官能团，饱和的或不饱和的烃链或聚乙二醇(直链的、支链的或环状的)、肽序列或聚合物。优选地，多个探针元件包含至少两个探针元件、至少三个探针元件、至少四个探针元件或至少五个探针元件。例如，多个探针元件可以包含三个探针元件。结合部分可以选择性地结合至少一些细菌，并且不结合或者微弱地结合动物细胞诸如例如哺乳动物细胞。因此，结合部分可以是细菌结合部分。细菌结合部分可以基本上结合所有细菌，但不结合或者微弱地结合动物细胞。细菌结合部分可以选择性地基本上结合革兰氏阴性细菌，但不结合或微弱地结合革兰氏阳性细菌或动物细胞诸如哺乳动物细胞。结合部分可以选择性地结合真菌，并且不结合动物细胞诸如例如哺乳动物细胞。因此，结合部分可以是真菌结合部分并且可以结合真菌菌丝。结合部分可以选择性地结合至少一些细菌和至少一些真菌，并且不结合动物细胞诸如哺乳动物细胞。因此，探针可以允许检测靶区域中的真菌和/或细菌。例如，结合部分可以适于结合烟曲霉(A.fumigatus)的真菌菌丝。一个或更多个探针元件的结合部分可以是ubiquicidin部分，诸如全长ubiquicidin(SEQIDNO.1)或其片段或变体。结合部分可以是包含ubiquicidin的至少10个连续氨基酸或至少12个连续氨基酸的ubiquicidin的片段。例如，结合部分可以是氨基酸29至41的ubiquicidin片段(UBI29-41，SEQIDNO.2)。结合部分可以是包含一个或更多个取代的ubiquicidin部分。该取代或每个取代可以是保守取代，并且对ubiquicidin的细菌结合性质几乎没有影响或优选地没有影响。该取代或每个取代可以向ubiquicidin部分提供抗降解或氧化的稳定性。例如，结合部分可以是包含正亮氨酸氨基酸取代原始的甲硫氨酸氨基酸的UBI29-41(UBI29-41Nle，SEQIDNO.3)。ubiquicidin是存在于呼吸道上皮细胞、肠粘膜和巨噬细胞中的哺乳动物抗微生物肽。ubiquicidin特异性地结合原核生物如细菌的细胞膜并且不结合哺乳动物细胞。一个或更多个探针元件的结合部分可以选择性地结合革兰氏阳性细菌并且可以基本上不结合革兰氏阴性细菌。优选地，一个或更多个探针元件的结合部分选择性地结合革兰氏阴性细菌并且基本上不结合革兰氏阳性细菌。因此，在其中一个或更多个探针元件的结合部分选择性地结合革兰氏阴性细菌的实施方案中，本专利技术的探针可以随机分布在不包含革兰氏阴性细菌的靶区域中，并且定位于存在于靶区域的任何革兰氏阴性细菌的细胞膜中。因此，本专利技术的探针可以适于选择性地指示靶区域中存在或不存在革兰氏阴性细菌。例如，一个或更多个探针元件的结合部分可以是多粘菌素部分，诸如全长多粘菌素(SEQIDNO.4)或其片段或变体。多粘菌素选择性地结合革兰氏阴性细菌，并且因此，包含多粘菌素部分的细菌结合部分将选择性地仅将相应探针部分结合至革兰氏阴性细菌，并从而允许检测靶区域内的任何革兰氏阴性细菌。结合部分可以是包含多粘菌素的至少6个连续氨基酸或至少8个连续氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种探针，所述探针包括核心和多个探针元件；所述多个探针元件中的每个探针元件从所述核心延伸且包含荧光团和结合部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.13 GB 1420221.21.一种探针，所述探针包括核心和多个探针元件；所述多个探针元件中的每个探针元件从所述核心延伸且包含荧光团和结合部分。2.根据权利要求1所述的探针，其中所述多个探针元件包含至少三个探针元件。3.根据权利要求1或权利要求2之一所述的探针，其中所述结合部分是细菌结合部分并且选择性地结合至少一些细菌，并且不结合或微弱地结合动物细胞诸如哺乳动物细胞。4.根据权利要求1或权利要求2之一所述的探针，其中所述结合部分是真菌结合部分。5.根据前述权利要求中任一项所述的探针，其中所述结合部分能够选择性地结合至少一些细菌和至少一些真菌，并且不结合或微弱地结合动物细胞诸如哺乳动物细胞。6.根据权利要求3或5之一所述的探针，其中一个或更多个所述探针元件的所述结合部分是ubiquicidin部分，诸如全长ubiquicidin(SEQIDNO.1)或其片段或变体。7.根据权利要求6所述的探针，其中所述结合部分是氨基酸29至41的ubiquicidin片段(UBI29-41，SEQIDNO.2)。8.根据权利要求6所述的探针，其中所述结合部分是包含正亮氨酸氨基酸取代原始的甲硫氨酸氨基酸的UBI29-41(UBI29-41Nle，SEQIDNO.3)。9.根据权利要求中任一项所述的探针，其中一个或更多个所述探针元件的所述结合部分选择性地结合革兰氏阴性细菌且基本上不结合革兰氏阳性细菌。10.根据权利要求9所述的探针，其中一个或更多个所述探针元件的所述结合部分是多粘菌素部分，诸如全长多粘菌素(SEQIDNO.4)或其片段或变体。11.根据前述权利要求中任一项所述的探针，其中所述多个探针元件中的每个探针元件包含相同的荧光团。12.根据权利要求1至10中任一项所述的探针，其中每个探针元件包含不同的荧光团。13.根据前述权利要求中任一项所述的探针，其中所述多个探针元件中的每个探针元件的荧光团是环境敏感性荧光团，使得所述荧光团的荧光的强度或量子收率取决于所述荧光团的环境。14.根据权利要求13的探针，其中所述荧光团的量子收率或强度在疏水性环境诸如细胞膜中较高。15.根据前述权利要求中任一项所述的探针，其中所述多个探针元件中的一个或更多个所述探针元件的所述荧光团是7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)、孔雀绿、苯乙烯基染料、瀑布黄、prodan(也被称为1-丙酮，1-(6-(二甲基氨基)-2-萘基)、丹磺酰(也被称为5-(二甲基氨基)萘-1-磺酰基)、Dapoxyl、PyMPO(也被称为1-(3-(琥珀酰亚氨基氧基羰基)苄基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓)、芘和二乙基氨基香豆素或其衍生物或变体。16.根据权利要求15所述的探针，其中所述多个探针元件中的至少一个探针元件的荧光团是NBD部分。17.根据权利要求16所述的探针，其中所述多个探针元件中的每个探针元件的荧光团是NBD部分。18.根据权利要求1至12中任一项所述的探针，其中所述多个探针元件中的一个或更多个所述探针元件的荧光团具有长荧光寿命，并且所述荧光团的长荧光寿命允许相对于背景自体荧光检测所述探针。19.根据权利要求18所述的探针，其中所述荧光团是氮杂二氧杂三角烯(ADOTA)染料或二氮杂氧杂三角烯(DAOTA)，或其衍生物。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一荧光团和/或所述第二荧光团发射光谱的近红外或红外范围内的光。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述荧光团可通过光声成像检测。22.根据前述权利要求中任一项所述的探针，其中所述多个探针元件中的相邻探针元件的一个或更多个荧光团能够猝灭所述探针的一个或更多个其他荧光团的荧光。23.根据权利要求22所述的探针，其中当所述探针的环境变化时，自猝灭被阻止或减少。24.根据前述权利要求中任一项所述的探针，其中所述结合部分在所述探针元件最远离所述核心的远端。25.根据权利要求1至23中任一项所述的探针，其中所述结合部分在所述探针元件的近端并且邻近所述核心，并且所述探针元件的所述荧光团通过所述结合部分连接到所述核心。26.根据前述权利要求中任一项所述的探针，其中探针元件的所述结合部分和所述荧光团通过通用连接物连接到所述核心，并且所述结合部分和所述荧光团的每个远离所述连接物延伸。27.根据权利要求25所述的探针，其中所述荧光团直接连接至所述结合部分。28.根据权利要求25所述的探针，其中所述荧光团通过间隔物连接至所述结合部分。29.根据权利要求28所述的探针，其中所述间隔物是肽、饱和或不饱和的烃链、醚、聚合物、聚乙二醇(PEG)、聚二醇、聚醚或类似物。30.根据前述权利要求中任一项所述的探针，其中所述探针包含通过可裂解接头连接至所述核心的猝灭剂；当所述核心通过所述可裂解接头连接至所述猝灭剂时，所述多个探针元件中的一个或更多个所述探针元件的所述荧光团基本上被所述猝灭剂荧光猝灭；其中当所述可裂解接头被裂解时，所述核心被从所述猝灭剂分离，且从而所述多个探针元件被从所述猝灭剂分离。31.根据权利要求30所述的探针，其中使得所述接头的尺寸为使所述猝灭剂足够靠近所述多个探针元件的至少一个的荧光团以猝灭所述荧光团。32.根据权利要求1至29中任一项所述的探针，其中所述探针包含连接到所述核心的猝灭剂，并且所述多个探针元件通过可裂解接头连接至所述核心；当所述多个探针元件中的所述探针元件或每个探针元件连接至所述核心，并从而连接至所述淬灭剂时，所述多个探针元件中的一个或更多个所述探针元件的所述荧光团基本上被所述猝灭剂荧光猝灭；其中当所述可裂解接头被裂解时，所述核心从所述多个探针元件分离，且从而所述猝灭剂从所述多个探针元件分离。33.根据前述权利要求中任一项所述的探针，其中所述可裂解接头包含酶可裂解肽序列，且当裂解酶裂解所述酶可裂解肽序列时所述接头被裂解。34.根据权利要求33所述的探针，其中所述裂解酶是弹性蛋白酶并且所述酶可裂解肽序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：马克·布拉德利，安娜玛丽亚·海伦娜·利林坎普夫，尼古劳斯·阿夫洛尼蒂斯，马克·文德雷利·埃斯科巴尔，尼尔·亚历山大·麦克唐纳，克里斯多佛·哈斯莱特，卡恩瓦尔迪普·达利瓦，蒂莫西·西蒙·沃尔什，
申请(专利权)人：爱丁堡大学董事会，
类型：发明
国别省市：英国,GB