一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，是采用Tet‑On诱导型逆转录病毒载体，通过添加Doxycycline以诱导MLL‑AF9融合基因在成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达，获得髓系细胞系。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供的一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，通过条件性表达MLL‑AF9获得的永生化的髓系细胞系和成年小鼠骨髓中的原代髓系细胞相比，具有相似的表面标志物，即CD11b

Preparation method of immortalized mouse myeloid cell line

The invention discloses a method for preparing immortalized murine myeloid cell lines, using Tet On inducible retroviral vector by adding Doxycycline to induce the MLL fusion gene AF9 in adult bone marrow blood progenitor / stem cells, myeloid cell lines obtained. The beneficial effects of the invention are: an immortalized mouse myeloid cell lines were prepared by the method provided by the invention, through conditional bone marrow myeloid cell lines MLL AF9 immortalized and adult mice in primary myeloid cells compared with similar surface markers, namely CD11b

【技术实现步骤摘要】
一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法
本专利技术涉及细胞工程
，具体涉及一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法。
技术介绍
MLL-AF9融合基因在婴儿与髓系和淋巴系侵袭性白血病都有相关性，而在成体，这种易位主要与急性髓系白血病相关。这些结果暗示在胚胎和成体组织白血病发展的细胞来源方面存在差异。我们猜测细胞来源的内在特性在决定白血病的谱系方面扮演了重要角色。事实上，新生儿CD34+细胞表达MLL-AF9可永生化为髓系或淋巴系细胞，而成体骨髓CD34+细胞的永生化更难以实现，且具有强烈的髓系偏好性。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法。本专利技术技术方案的设计思路为：为获得具有永生化能力的小鼠血液髓系细胞，申请人在来源于成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达MLL-AF9融合基因。这种策略产生了克隆化的并依赖于细胞因子的髓系细胞系。由于正常的髓系细胞本身并不表达MLL-AF9，在血液细胞中异位表达MLL-AF9可能会改变这些细胞，改变原代髓系细胞的某些生物学特性。为克服这一缺陷，申请人拟采用Tet-On诱导型逆转录病毒载体，通过添加Doxycycline来诱导MLL-AF9基因在成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达，获得髓系细胞系；而在这些永生化的髓系细胞用于生物学功能实验前，撤销Doxycycline，终止MLL-AF9基因的表达。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，是采用Tet-On诱导型逆转录病毒载体，通过添加Doxycycline以诱导MLL-AF9融合基因在成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达，获得髓系细胞系。进一步的，上述的一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，所述MLL-AF9融合基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQNo.1所示。进一步的，上述的一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，包括以下步骤：1）用BamHI/XhoI双酶切从TtRMPVIR质粒上切下dsRed基因片段，并将带BamHI/XhoI黏性末端的MLL-AF9cDNA连接入逆转录病毒载体TtRMPVIR质粒，成功构建的质粒命名为VIR-MLL-AF9；dsRed基因的表达受四环素调节元件TREtight严格调控，载体组成型表达反式作用因子rtTA3，在Doxycycline的作用下发生构象变化，激活四环素调节元件TREtight，启动下游基因的表达；撤销Doxycycline，则下游基因的表达终止；2）将VIR-MLL-AF9质粒转染逆转录病毒包装细胞系GP+E-86，获得条件性表达MLL-AF9融合基因的逆转录病毒；所述细胞系GP+E-86包含莫罗尼氏鼠白血病病毒Mo-MuLV的gag，pol和env区域；3）将10-12周龄的C57BL/6小鼠在获取骨髓3天前用5-氟尿嘧啶按150mg/kg处理，获取骨髓后在IMDM培养基中培养48小时，培养基中添加10%胎牛血清，0.15mM的MTG，100ng/mL的SCF，10ng/mL的IL-6和10ng/mL的IL-3；4）用含有4μg/mLPolybrene的逆转录病毒上清液转导步骤3）所述骨髓细胞，室温，转速2000rpm离心90分钟，将细胞转移至培养箱孵育6小时后，弃去含Polybrene的的逆转录病毒上清液，更换为步骤3）所述的添加有各种成分的IMDM培养基，培养48小时，用流式细胞仪分析Venus+的Lineage-Sca-1+c-kit+细胞，Lineage包含CD3ε，B220，TER-119，CD11b，和Gr-1；分选出的细胞培养于步骤3）所述的添加有各种成分的IMDM培养基，并添加1μg/mL的Doxycycline；最后存活的细胞即为永生化的小鼠髓系细胞。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，通过条件性表达MLL-AF9获得的永生化的髓系细胞系（图2右侧）和成年小鼠骨髓中的原代髓系细胞（图2左侧）相比，具有相似的表面标志物，即CD11b+，但永生化的髓系细胞系极易扩增，获得大量均一的细胞群体。附图说明图1显示为逆转录病毒载体TtRMPVIR质粒的图谱。图2显示为永生化的髓系细胞系在髓系细胞生长因子作用下的分化情况。图3显示为永生化的髓系细胞系在Giemsa染色后镜下观察细胞核的特点。图4显示为永生化的髓系细胞系在添加髓系细胞生长因子的methylcellulose培养基中培养，形成克隆集落的能力。具体实施方式实施例1：一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，是采用Tet-On诱导型逆转录病毒载体，通过添加Doxycycline以诱导MLL-AF9基因在成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达，获得髓系细胞系；MLL-AF9基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQNo.1所示。其具体操作过程为：逆转录病毒载体TtRMPVIR质粒的模式图如图1所示。dsRed基因的表达受四环素调节元件TREtight严格调控。该载体组成型表达反式作用因子rtTA3，在Doxycycline的作用下可发生构象变化，激活四环素调节元件TREtight，启动下游基因的表达；撤销Doxycycline，则下游基因的表达终止。用BamHI/XhoI双酶切从TtRMPVIR质粒上切下dsRed基因片段，并将带BamHI/XhoI黏性末端的MLL-AF9cDNA连接入该逆转录病毒载体，成功构建的质粒命名为VIR-MLL-AF9。将VIR-MLL-AF9质粒转染逆转录病毒包装细胞系GP+E-86（该细胞系包含莫罗尼氏鼠白血病病毒Mo-MuLV的gag，pol和env区域），可获得条件性表达MLL-AF9基因的逆转录病毒。将10-12周龄的C57BL/6小鼠在获取骨髓3天前用5-氟尿嘧啶（5-FU）按150mg/kg处理。获取骨髓后在IscovesmodifiedDulbeccomedium(IMDM)培养基中培养48小时，培养基中添加10%胎牛血清(FCS)，0.15mMmonothiolglycerol(MTG)，100ng/mLSteelfactor(SF)，10ng/mLinterleukin-6(IL-6)和10ng/mLinterleukin-3(IL-3)。用含有4μg/mLPolybrene的逆转录病毒上清液转导上述骨髓细胞，室温2000rpm离心90分钟。将细胞转移至培养箱孵育6小时后，弃去含Polybrene的的逆转录病毒上清液，更换为上述添加各种成分的IMDM培养基。培养48小时，用流式细胞仪分析Venus+的Lineage-Sca-1+c-kit+(LSK)细胞，Lineage包含CD3ε(145-2C11),B220(RA3-6B2),TER-119,CD11b(M1/70),andGr-1(RB6-8C5)。分选出的细胞培养于上述添加各种成分的IMDM培养基，并添加1μg/mL的Doxycycline。最后存活的细胞即为永生化的小鼠髓系细胞。将转化MLL-AF9的骨髓细胞在髓系细胞生长因子cocktail中培养5天后，经流式细胞术检测，如图2所示，永生化的髓系细胞系可表达髓系细胞表面标志物CD11b，还有部分细胞表达粒细胞表面标志物Gr-1,部分细胞表达树突本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，其特征在于，是采用Tet‑On诱导型逆转录病毒载体，通过添加Doxycycline以诱导MLL‑AF9融合基因在成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达，获得髓系细胞系。

【技术特征摘要】
1.一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，其特征在于，是采用Tet-On诱导型逆转录病毒载体，通过添加Doxycycline以诱导MLL-AF9融合基因在成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达，获得髓系细胞系。2.根据权利要求1所述的一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，其特征在于，所述MLL-AF9融合基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQNo.1所示。3.根据权利要求1或2所述一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）用BamHI/XhoI双酶切从TtRMPVIR质粒上切下dsRed基因片段，并将带BamHI/XhoI黏性末端的MLL-AF9cDNA连接入逆转录病毒载体TtRMPVIR质粒，成功构建的质粒命名为VIR-MLL-AF9；dsRed基因的表达受四环素调节元件TREtight严格调控，载体组成型表达反式作用因子rtTA3，在Doxycycline的作用下发生构象变化，激活四环素调节元件TREtight，启动下游基因的表达；撤销Doxycycline，则下游基因的表达终止；2）将VIR-MLL-AF9质粒转染逆转录病毒包装细胞系GP+E-...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹欣，蔡葵蒸，马晓霞，薛宇佳，许强，王波波，
申请(专利权)人：西北民族大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62