一种鲫鱼冠状病毒HB93及RT‑PCR检测引物及应用制造技术

本发明专利技术属于病毒检测领域，具体公开了一种鲫鱼冠状病毒HB93及RT‑PCR检测引物及应用，发明专利技术人首次从鲫鱼中分离出了一种鲫鱼冠状病毒，该病毒为鲫鱼冠状病毒（Crucian Carp Bafinivirus）HB93，针对该病毒序列设计引物，F1：5'‑CAAAGTAAACCCTGGAGA‑3'，R1：5'‑ATCAATGATGGTGCAGTT‑3'；F2：5'‑TGAAACAATCCAAGAAGA‑3'，R2：5'‑ACAAGTTATAGCCGGTGT‑3'，可对鲫鱼冠状病毒进行检测，该引物的特异性好，灵敏度高。

A HB93 and RT carp coronavirus primers for PCR detection and Application

The invention belongs to the field of virus detection, a HB93 and RT carp coronavirus PCR detection primer and application specific open inventor for the first time from carp isolated a carp coronavirus, the virus for crucian carp (Crucian Carp coronavirus Bafinivirus HB93), against the virus primers, F1:5'CAAAGTAAACCCTGGAGA 3'. R1:5'ATCAATGATGGTGCAGTT 3' F2:5'; TGAAACAATCCAAGAAGA 3', R2:5'ACAAGTTATAGCCGGTGT 3', can detect the carp coronavirus, the specificity of the primer, high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种鲫鱼冠状病毒HB93及RT-PCR检测引物及应用
本专利技术属于病毒分子检测
，具体涉及一种鲫鱼冠状病毒HB93及RT-PCR检测引物及应用。技术背景国际病毒分类委员会(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)于2012年发表了最新的病毒分类第九次报告，将套式病毒目(Nidovirales)中的冠状病毒科(Coronaviridea)中新设冠状病毒亚科(Coronavirinea)和环曲病毒亚科(Torovirinae)。冠状病毒科是一类线形单股正链RNA病毒，最早于1937年从鸡身上分离出来，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒[1]。1975年，国际病毒命名和分类委员会正式命名了冠状病毒科。2002-2003年期间，自我国局部地区发生的非典型肺炎，即由冠状病毒属的严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)引起，世界上有30多个国家和地区相继报道出现病例，病死率超过10％。2012年，中东地区开始出现新型冠状病毒，病死率超过50％，引起了世界范围的广泛关注，造成社会对冠状病毒的恐慌。因此，对冠状病毒进行深入研究具有重要意义。目前对冠状病毒科的研究主要集中在冠状病毒亚科，而对环曲病毒亚科研究甚少。其中，2006年鳊鱼病毒属(Bafinivirus)的中的鳊鱼病毒(Whitebreamvirus)由SchützeH等科学家在鳊鱼体内发现，这也是目前ICTV分类中确定的唯一以水生动物为宿主的冠状病毒。目前鲫鱼冠状病毒(CrucianCarpBafinivirus,CCBV)尚无公开报道，更也无有效的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种鲫鱼冠状病毒HB93，所述的病毒分离自鲫鱼病变细胞，该病毒已于2017年5月11日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：鲫鱼冠状病毒(CrucianCarpBafinivirus)HB93，保藏编号：CCTCCNO：V201722，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术的另一个目的在于提供了基于鲫鱼冠状病毒HB93的全序列(SEQIDNO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的引物，利用该引物可用于检测鲫鱼冠状病毒HB93。本专利技术的还有一个目的在于提供一种鲫鱼冠状病毒HB93RT-PCR检测引物，所述的引物为F1：5'-CAAAGTAAACCCTGGAGA-3'，R1：5'-ATCAATGATGGTGCAGTT-3'；F2：5'-TGAAACAATCCAAGAAGA-3'，R2：5'-ACAAGTTATAGCCGGTGT-3'。本专利技术还有一个目的在于提供了鲫鱼冠状病毒HB93的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成鲫鱼冠状病毒病疫苗，或是制备成鲫鱼冠状病毒的实验室对照品。本专利技术的最后一个目的在于提供一种鲫鱼冠状病毒HB93RT-PCR检测引物的应用，包括利用所述的应用制备成鲫鱼冠状病毒检测试剂盒。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种鲫鱼冠状病毒HB93，所述的病毒分离自鲫鱼病变细胞，该病毒已于2017年5月11日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：鲫鱼冠状病毒(CrucianCarpBafinivirus)HB93，保藏编号：CCTCCNO：V201722，地址：中国武汉武汉大学。将鲫鱼冠状病毒HB93(本专利技术或称为CCBV-HB93)接种到草鱼性腺细胞(Grasscarpovarycellline,GCO)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见GCO细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂。培养基：M199，10％胎牛血清，pH7.0～7.2。鲫鱼冠状病毒HB93的形态特征：病毒呈棒状，四周有明显的日冕状棘突结构，与典型的冠状病毒形态相符。鲫鱼冠状病毒HB93的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成鲫鱼冠状病毒病疫苗，或是制备成鲫鱼冠状病毒的实验室对照品。本专利技术的保护内容还包括基于鲫鱼冠状病毒HB93的全序列(SEQIDNO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的引物，所述的引物包括基于该差异序列，利用现有技术设计的诸如荧光定量引物，LAMP引物，数字PCR引物等，利用该引物可用于检测鲫鱼冠状病毒HB93。一种鲫鱼冠状病毒HB93RT-PCR检测引物，包括F1：5'-CAAAGTAAACCCTGGAGA-3'，R1：5'-ATCAATGATGGTGCAGTT-3'；F2：5'-TGAAACAATCCAAGAAGA-3'，R2：5'-ACAAGTTATAGCCGGTGT-3'。一种鲫鱼冠状病毒HB93RT-PCR检测引物的应用，包括利用上述引物制备成用于检测鲫鱼冠状病毒检测试剂盒，或直接用于鲫鱼冠状病毒的检测。优选的，当制备成试剂盒时，该试剂盒的非诊断性检测方法包括：一种鲫鱼冠状病毒的RT-PCR检测方法，步骤包括：1)提取待测样品的RNA并逆转录为cDNA；2)PCR体系采用25μl反应体系：浓度为40μM的两对引物F1、R1或F2、R2分别各取0.5μL加入两只PCR反应管，两个PCR反应管中再分别加入2.5mMdNTPs2μL，25mMMgCl21.5μL，5UTaq聚合酶0.5μL，模板cDNA1μl，10×ThermoPolReactionBuffer2.5μl，用灭菌双蒸水将两管反应体系均补齐至25μL。反应条件，95℃预变性5min；95℃30s、48℃30s、72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。3)检测结果判定聚合酶链式反应扩增的最终反应产物取4μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。电泳图片显示343bp和389bp特征性条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术首次自鲫鱼中分离出了冠状病毒，对于鲫鱼冠状病毒的研究具备开拓性的意义。1.本专利技术的方法快速简便：本专利技术所建的RT-PCR方法只需数小时，相比较传统病毒分离方法数天时间，极大的提高了检测效率。2.本专利技术的方法特异性强：两对引物对靶序列的特异序列区的识别，保证了PCR方法扩增的高度特异性。附图说明图1为本专利技术提供的引物的灵敏度的实验结果示意图；其中，泳道1：原始模板、泳道2：10倍稀释、泳道3：100倍稀释、泳道4：1000倍稀释、泳道5：10000倍稀释、泳道6：100000倍稀释、泳道7：1000000倍稀释。图2为利用本专利技术提供的引物对感染鲫鱼冠状病毒HB93的鲫鱼组织进行检测的结果示意图；其中泳道P：阳性对照；M：marker泳道1：待测样品1；泳道2：待测样品2；泳道3：待测样品3；泳道4：待测样品4。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。实施例1：一种鲫鱼冠状病毒HB93，其分离过程如下：1)将携带病毒的鲫鱼肝、脑、脾、肾等组织取出并碾磨后，培养基稀释100倍，2000rpm离心后取上清过滤，接种到草鱼性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鲫鱼冠状病毒，所述的鲫鱼冠状病毒为鲫鱼冠状病毒（Crucian Carp Bafinivirus）HB93。

【技术特征摘要】
1.一种鲫鱼冠状病毒，所述的鲫鱼冠状病毒为鲫鱼冠状病毒（CrucianCarpBafinivirus）HB93。2.权利要求1所述的鲫鱼冠状病毒HB93的RT-PCR检测引物，所述的引物为F1：5'-CAAAGTAAACCCTGGAGA-3'，R1：5'-ATCAATGATGGTGCAGTT-3'；F2：5'-TGAAACAATCCAAGAAGA-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈孝宇，梁昊，郭少飞，陈鑫，
申请(专利权)人：湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：湖北,42