用于评价细菌细胞壁完整性的方法技术

本发明专利技术涉及在作用于细菌细胞壁的抗生素的存在下用于评价存在于培养物中的细菌的细胞壁完整性的方法，从实用的角度出发，该方法允许快速地确定细菌是否对作用于细胞壁的抗生素敏感或耐受。同样地，本发明专利技术还涉及适用于前述方法的裂解溶液，具体地影响具有被作用于细菌细胞壁的抗生素损坏的细胞壁的细菌，这允许从对所述抗生素耐受的细菌中区分对所述抗生素敏感的细菌。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于评价细菌细胞壁完整性的方法
本专利技术涵盖在生物技术产业领域内，并且主要涉及微生物学，其应用范围是在卫生部门(人类健康、动物健康、环境健康和基础健康)中。本专利技术涉及在作用于细菌细胞壁的抗生素的存在下评价存在于培养物中的细菌细胞壁的完整性的方法，从实用的角度出发，该方法允许快速地确定细菌是否对作用于细胞壁的抗生素敏感或耐受。
技术介绍
关于微生物对抗微生物药剂的敏感性的研究是临床微生物学实验室最重要的职责之一。该研究通过敏感性测试或抗菌谱(antibiogram)进行,其主要目的是在实验室中评价微生物对一个或几个抗微生物药剂的响应(反应，response)。一些在日常临床实践中最常用的方法包括(i )扩散法，如基于Bauer、Kirby等人工作的圆盘-培养皿抗菌素谱(disc-dish antibiogram) (Bauer A ff,等人.Am.J.Clin.Pathol.1966，45:493-496)或 ε -测试或 E-测试法(AB Biodisk，瑞典)，或(ii )稀释法，如琼脂稀释法或肉汤微量稀释法。通过比较扩散法与稀释法，后者在技术上更为复杂，而且几乎总是更加昂贵，特别是当使用商业微量稀释板时。液体培养基中的微量稀释法是常规临床微生物学实验室实践中最常用的方法。在许多实验室中，商业板的使用是基于使用半自动的孵育-读数-判读(incubation-reading-1nterpretation)系统；这促进了它们的应用，但具有增加支出的缺点。一些公司已经在市场上推出 板，其中培养基包含允许快速获取(少于8小时)结果的荧光指示剂。关于对作用于细菌壁的抗生素(如内酰胺类)的耐受性的快速测定，将可代谢的荧光化合物添加到培养基中(专利申请W0/1992/019763)。如果有机体在抗生素下生长，那么细菌的代谢作用导致荧光团的释放。如果有机体不生长，那么样品的荧光增加。另一种可能性是使用颜色指示剂化合物如四唑，在对抗生素敏感的事件中，在添加电子载体如吩嗪硫酸甲酯后，其会引起颜色的变化。然而，仍然没有足够的数据来允许建议常规应用这种板。几个商业公司也正在评价专家系统(软件)，该专家系统促进所获得结果的临床解释；假设在未来广泛使用这样的系统是安全。在当今市场上几个系统是可获得的，MicroScan WalkAway、Vitek和Wider是最突出的系统。缺乏较多的使用突光指示剂的临床经验时，如上面提到的扩散方法中，用于获得特定微生物对抗微生物剂的易感性的平均响应时间的范围在18和24小时之间。最近，已指出利用双向电泳系统的可能性，其检测施用抗生素后细胞在电生理学方面的变化(Hoettges KF, Dale Jff, HughesMP.Rapid determination of antibioticresistance in E.coli using dielectrophoresis.Phys Med Biol2007;52:6001-6009)。对于作用于细菌壁的抗生素如β_内酰胺类的另一个开发由通过特定基质检测由细胞释放到培养基中的细胞质酶的活性组成，如果该抗生素已被实施(effective)(欧洲专利 EP0135023)。BACcelr8r?是由Accelr8正在开发的平台，用于自动识别微生物并研究其对抗生素的耐受性。它不使用培养物，细菌的分离也不是必要的。它通过多个盒的方式工作，其中每个盒对应于一个样品。它使用具有由计算机、数字相机和分析软件控制的显微镜的自动化系统。泵在不同条件下维持含细菌的培养基经过盒的流。可在8小时内完成抗生素耐受性分析。专利申请US2004/0014066描述了用于检测样品中影响细胞完整性的抗生素活性的方法，其包括(a)提供包含编码启动子的核酸的转化的微生物，该核酸被可操作地连接到能够发出可检测信号的异源报告基因，并且(b)使样品与转化的微生物接触，(c)观察所述微生物的所述可检测信号，其中该启动子由双组分信号转导系统调控，其中所述组分为(i)对微生物的细胞被膜或细胞膜的变化敏感的受体及(ii )反式作用因子，其响应于受体引起的刺激而激活并调控启动子。作用于细菌壁的抗生素细菌细胞壁的骨架由杂聚物、胞壁质肽聚糖构成。该大分子由N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)和N-乙酰胞壁酸(NAM)通过β -1, 4键彼此结合的交替序列而形成。形成细胞壁的基本结构的链为直的、无支链的链。该N-乙酰胞壁酸具有与短肽链(四肽)连接的乳酸基团。此链的典型氨基酸包括L-丙氨酸、D-谷氨酸、间-二氨基庚二酸或L-赖氨酸或D-丙氨酸。抑制细菌壁合成的抗生素是作用于细菌壁合成不同步骤的不同家族的药物:-环丝氨酸是D-丙氨酸类似物并竞争性地抑制该氨基酸与酶D-丙氨酸-D-丙氨酸合成酶和丙氨酸消旋酶的结合，从而防止它们结合到肽聚糖前体。-磷霉素阻断肽聚糖前体的合成。-杆菌肽抑制^--异戍烯基(undecaprenyl)、运送肽聚糖至细胞外的脂质载体的回收利用。-葡糖肽(glucop印tide)或葡糖肽类抗生素是一类糖结合到其上(如在细菌细胞壁中)的肽，其具有对这种结构的前体的高亲和力。最知名的糖肽类抗生素是万古霉素和替考拉宁(teicoplanin)。万古霉素通过抑制细菌细胞壁合成、结合到革兰氏阳性菌壁上的五肽的D-丙氨酸-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)片段、阻断肽与细胞的结合来执行其杀菌作用。其次，万古霉素能通过其他机制如破坏细胞质膜的渗透性及抑制RNA合成而见效，这是在药已结合到肽聚糖后进行的。-β -内酰胺类抗生素通过干扰交联所必需的横向结合或肽间桥(interpeptidebridge)来执行杀菌作用。其通过以不可逆方式结合至PBPs、丝氨酸蛋白酶或转肽酶来抑制它们的活性。-干扰细胞壁合成的其他抗生素为异烟肼、乙硫异烟胺和乙胺丁醇。如同上面提到的环丝氨酸，它们被用于分枝杆菌感染的治疗。异烟肼具有在活跃复制期内的杀菌活性。其影响分枝菌酸(mycolic acid)的合成,打断脂肪酸的伸长。乙硫异烟胺也抑制分枝菌酸的合成。乙胺 丁醇干扰细胞壁阿拉伯半乳聚糖的合成。对这些抗生素的耐受性的原因在于缺乏渗透进入细菌和/或修饰它们的细胞靶标。抗生素耐受导致每年数万的死亡。使用正确选择有效性的抗生素治疗来避免这些死亡中的许多。考虑到耐受水平，有必要制备细菌培养物，随后制备抗菌谱。为了完成以上所述，细菌必须通常生长2-3天。对于普通的快速生长的细菌，抗菌谱本身通常需要至少一天的培育。对于IUC中病情危急的患者，迅速的抗生素治疗是重要的。考虑到抗菌谱的延迟，其以经验为主地进行。这种治疗在20%-40%的病例中是无效的，而在得到抗菌谱的结果后治疗的改变可能不再有效。在这种情况下，得到快速的抗菌谱系统是重要的。作用于细菌壁的抗生素，特别是β_内酰胺类，是一个非常大的群体，且最常被用于抗感染治疗中。对得到这些抗生素的快速抗菌谱系统非常感兴趣。
技术实现思路
本专利技术的作者已经发现，对于细菌，作用于细菌细胞壁的抗生素的活性的一个后果是将胞外DNA片段释放到培养基中。为了观察这种作用，本专利技术人在所述抗生素的存在下孵育对氨苄青霉素(β -内酰胺类抗生素)敏感的大肠杆菌菌株，之后在几个载玻片上将培养物包含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在作用于细菌细胞壁的抗生素的存在下评价纯培养物中细菌的细胞壁的完整性的方法，其包括: i)将作用于细菌细胞壁的抗生素加入到所述细菌的所述纯培养物中，和 ? )确定培养基中胞外DNA片段的存在， 其中，所述培养基中胞外DNA片段的存在指示所述细菌的细胞壁的完整性已被破坏。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括在步骤(i)和(ii )之间将来自于步骤(i)的所述培养物的样品固定在载玻片上。3.一种用于在作用于细菌细胞壁的抗生素的存在下评价存在于培养物中的细菌的细胞壁的完整性的方法，其包括: i)将作用于细菌细胞壁的抗生素加入到所述培养物中， ii )将裂解溶液加入到产生自步骤i )的所述培养物中，其中，所述裂解溶液是对细胞壁已被所述作用于细菌细胞壁的抗生素破坏的细菌特异的裂解溶液，并包含具有在3至11.5之间的PH的缓冲液，和 iii)确定细菌类核的存在， 其中，所述培养基中细菌类核的存在指示所述细菌的细胞壁的完整性已被破坏。4.根据权利要求3所述的方法，其中，存在于所述培养物中的细菌属于相同物种或不同物种。5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述裂解溶液进一步包含上达至3%的离子型去污剂或非离子型去污剂。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述离子型去污剂是选自由以下组成的组的去污剂:十二烷基硫酸钠 、烷基苯磺酸酯、月桂酰肌氨酸、甘氨胆酸盐水合物及它们的混合物。7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述非离子型去污剂选自由以下组成的组:叔辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇、N，N-双(3-D-葡糖酰氨基丙基)胆酰胺、二十三乙二醇十二烷基醚、N-癸酰基-N-甲基谷氨酰胺、洋地黄皂苷、十二酰基-N-甲基葡糖酰胺、庚酰基-N-甲基谷氨酰胺、支链的辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、N-辛酰基-N-甲基谷氨酰胺、司盘20溶液和聚山梨醇酯20。8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中，所述裂解溶液进一步包含上达至3M浓度的盐。9.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述裂解溶液包含0.2M的(羟甲基)-1，3-丙二醇、0.025%的十二烷基硫酸钠、0.5M或0.05M的氯化钠，且pH为10。10.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述裂解溶液包含0.2M的(羟甲基)-1,3-丙二醇、5%的Triton X-100、IM的氯化钠、且pH为10。11.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述裂解溶液包含0.3M的磷酸氢二钠、2%的十二烷基硫酸钠、0.05M的乙二胺四乙酸，且pH为11.45。12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在步骤(ii)之前或之后将来自所述培养物的样品固定在载体上。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，通过染色来进行培养基中胞外DNA片段的存在或细菌类核的存在的观察。14.根据权利要求13所述的方法，其中，通过使用一种或多种荧光染料来进行所述染色。15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述荧光染料选自由以下组成的组:赫斯特33342、赫斯特33258、DAP1、色霉素A3、光神霉素、溴化乙啶、吖啶橙、噻唑橙、7-AAD、青色素衍生物和荧光染料 TOTO、YOYO, BOBO, POPO, JOJO, LOLO, SYTOX, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO,TO-PRO, JO-PRO, PO-PRO 和 LO-PRO 的变异体。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述作用于细菌细胞壁的抗生素选自由以下组成的组:β -内酰胺类抗生素、...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔斯·路易斯·费尔南德斯加西亚，耶姆·戈萨尔韦兹贝伦格尔，格尔曼·博瓦雷瓦洛，玛丽亚·塔马约诺瓦斯，蕾韦卡·桑蒂索布兰达利兹，
申请(专利权)人：马德里自治大学，
类型：发明
国别省市：