一种重组肠激酶的制备方法技术

本发明专利技术一种重组肠激酶的制备方法属于生物【技术领域】。本发明专利技术提供了包含肠激酶基因的表达载体和工程菌，还提供了肠激酶的制备方法，包括培养工程菌、收获工程菌菌体、破碎得包涵体、洗涤和溶解包涵体、复性、酶原活化及纯化肠激酶的步骤。本发明专利技术的方法是重组肠激酶制备工艺成熟、质量稳定、纯度高、成本低，适合药用蛋白生产。

【技术实现步骤摘要】
一种重组肠激酶的制备方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种重组肠激酶的制备方法。
技术介绍
肠激酶(Enterokinase, EK)是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21.9)。天然肠激酶分子量为150kDa，由I条115kDa重链和I条35kD轻链组成，重链负责在消化道细胞膜上的锚定以及与肠激酶融合蛋白的结合，轻链具有催化活性，可以特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并在其羧基端切割,将肠激酶融合蛋白活化为肠激酶，从而启动消化道内各种酶原活化的级联反应。由于肠激酶识别位点的特异性和切割后在目标蛋白N末端不留任何氨基酸残基，而且可以在pH 4.5~9.5、温度4~45°C范围内特异性水解蛋白底物，因此它已经成为基因工程制药领域融合蛋白切割的的首选工具酶，广泛应用于各种重组蛋白、多肽药物的加工成熟。天然的肠激酶来源有限，需从动物组织分离提取，因为从动物组织提取的肠激酶易残留其他的蛋白酶，对融合蛋白的产生降解；另外，来源于动物组织的肠激酶可能带有未知病毒等动物源性污染，为药物蛋白生产增加了额外的风险。通过基因工程的方法生产的肠激酶轻链，具有天然肠激酶的全酶活性和特异性，在融合蛋白切割中被广泛应用。已有报道的重组肠激酶轻链多为实验室级别，存在大量宿主蛋白残留、镍离子残留和其他杂质，而且作为原辅料进行药物蛋白生产时，其残留不能被有效检测和控制，对药用蛋白的生产中增加许多风险。
技术实现思路
本专利技术提供一种重组肠激酶的制备方法，以克服现有技术中重组肠激酶轻链多为实验室规模制备，存在大量宿主蛋白残留、镍离子残留和其他杂质的技术缺陷。本专利技术的思路是这样的:通过合成N端带有肠激酶酶切位点的基因，连接到pET-32a(+)质粒中硫氧还蛋白后,在大肠杆菌宿主细胞内融合表达,表达的融合蛋白经外加少量肠激酶后，启动自切割，从而生产具有正确结构的重组肠激酶轻链，分子量约为35KD，含有活性重组肠激酶(35KD)的溶液经阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析和冷冻干燥后，可得高纯度、适合药用蛋白生产的重组肠激酶产品。专利技术人经过大量创造性劳动或得了本专利技术。本专利技术所要解决的技术问题之一是:提供一种包含肠激酶基因的表达载体。本专利技术所要解决的技术问题之二是:提供一种包含肠激酶基因的工程菌。本专利技术所要解决的技术问题之三是:提供一种重组肠激酶的制备方法。因此，本专利技术的技术方案如下: 1.一种包含肠激酶基因的表达载体，其特征在于肠激酶基因序列为Seq ID N0.1。2.根据1的表达载体，其特征在于，肠激酶基因Seq ID N0.1插入质粒pET_32a (+)的BglII和XhoI酶切位点之间。3.一种包含肠激酶基因的工程菌，其包含I或2所述的表达载体。4.一种包含肠激酶基因的工程菌，其特征在于，由将2所述的表达载体转化大肠杆菌BL21DE3而获得。5.一种重组肠激酶的制备方法，包括如下步骤:(I)培养3所述的包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达；(2)收集菌体；(3)破碎菌体；(4)收集包涵体，洗涤包涵体；(5)包涵体复性；(6)肠激酶原活化；和，(7)活性肠激酶的纯化。6.一种重组肠激酶的制备方法，包括如下步骤:(I)培养4所述的包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达；(2)收集菌体；(3)破碎菌体；(4)收集包涵体，洗涤包涵体；(5)包涵体复性；(6)肠激酶原活化；和，(7)活性肠激酶的纯化。7.根据5或6任一所述的重组肠激酶的制备方法，其特征在于:步骤(1)培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为:接种重组工程菌阳性克隆到LB培养基中，于25-37°C下摇床振荡培养过夜，按1-10%接种量接过夜菌于LB培养基中，37°C下摇床振荡培养到对数期，按1-10%接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧在35%以上，发酵培养基配方如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L,十二水合磷酸氢二钠8g/L,磷酸二氢钾4g/L,硫酸铵6g/L,七水硫酸镁1.13g/L, 二水氯化钙0.073g/L，补料培养基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中PH调控，当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，调节补料速度、转速、通气控制溶氧在30%以上，补料4h后，降温至23°C，调节pH至7.0,加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的IPTG进行有氧诱导，继续培养6h放罐。8.根据5或6任一所述的重组肠激酶的制备方法，其特征在于:步骤(1)培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为:接种重组工程菌阳性克隆200 μ I到20ml的LB培养基中，于30°C下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基中，37°C下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L发酵培养基的发酵罐中，初始参数为:发酵温度37°C，搅拌速度200rpm，通气量15L/min，pH为6.7，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在35 %以上，发酵培养基如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，通过控制泵的转速合理控制补料速度，控制溶氧在30%以上，补料4h后，降温至23°C，调节pH至7.0，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG进行有氧诱导，控制溶氧不低于20 %，6h后出罐。9.根据5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)破碎菌体的缓冲液为 25mmol/L Tris-HCl+5mmol/L EDTA, PH7.5。10.根据5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤⑷中洗涤包涵体的缓冲液为2mol/L尿素+1.5% Triton。11.根据5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(5)包涵体复性的缓冲液为 0.2mol/L 尿素 +1OmmoI/LEDTA+25mmoI/L Tis-HCL, GSH: GSSG = ImmoI/L: 0.3mmol/L, PH10。12.根据5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(6)肠激酶原活化的条件是经肠激酶在室温下酶解2-10小时，肠激酶/肠激酶原重量比为1/200。13.根据5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(7)活性肠激酶的纯化依次包括阴离子层析纯化、阳离子层析纯化和疏水层析纯化步骤。所述的“收集菌体”的方法包括但不限于离心包括连续离心、过滤等。所述的“破碎菌体”的方法，包括但不限于高压匀浆、渗透压冲击、冻融、超声波破碎等。所述的“收集包涵体”的方法，包括但不限于离心。所述的“洗涤包涵体”的方法，包括但不限于包涵体用纯化用书或者合适的缓冲液重悬、离心、再重悬离心等2~3个循环操作。包涵体变性和复性的方法可以按照本领域的技术人员公知的方法进行。本专利技术所说的肠激酶融合蛋白基因是指与牛肠激酶轻链基因序列的一致的cDNA序列，通本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含肠激酶基因的表达载体，其特征在于肠激酶基因序列为Seq ID N0.1。2.根据权利要求1的表达载体，其特征在于，肠激酶基因SeqID N0.1插入质粒pET-32a(+)的BglII和XhoI酶切位点之间。3.一种包含肠激酶基因的工程菌，其包含权利要求1或2所述的表达载体。4.一种包含肠激酶基因的工程菌，其特征在于，由将权利要求2所述的表达载体转化大肠杆菌BL21DE3而获得。5.一种重组肠激酶的制备方法，包括如下步骤: (1)培养权利要求3所述的包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达； (2)收集菌体； (3)破碎菌体； (4)收集包涵体，洗涤包涵体； (5)包涵体复性； (6)肠激酶原活化；和， (7)活性肠激酶的纯化。6.一种重组肠激酶的制备方法，包括如下步骤: (1)培养权利要求4所述的包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达； (2)收集菌体； (3)破碎菌体； (4)收集包涵体，洗涤包涵体； (5)包涵体复性； (6)肠激酶原活化；和， (7)活性肠激酶的纯化。7.根据权利要求5或6任一所述的重组肠激酶的制备方法，其特征在于:步骤(1)培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为:接种重组工程菌阳性克隆到LB培养基中，于25-37°C下摇床振荡培养过夜，按1-10%接种量接过夜菌于LB培养基中，.37°C下摇床振荡培养到对数期，按1-10%接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧在35%以上，发酵培养基配方如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中PH调控，当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，调节补料速度、转速、通气控制溶氧在30%以上，补料4h后，降温至23°C，调节pH至7.0，加入终浓度为 .0.1-0.5mmol/L的IPTG进行有氧诱导，继续培养6h放罐。8.根据权利要求5或6任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：文良柱，梅丽，朱亮，
申请(专利权)人：江苏万邦生化医药股份有限公司，上海复星医药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：