本发明专利技术公开了LAMP检测玉米MIR162的引物组、试剂盒及方法，所述引物由外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP和环引物LB组成，其核苷酸序列见SEQIDNo：1~5。本发明专利技术还保护了含有该引物的LAMP试剂盒。本发明专利技术的检测方法具有快速简便、准确灵敏的特点，在转基因产品管理和检验检疫工作中具有实际应用价值，尤其适用于基层实验室和现场检测的推广和应用。
【技术实现步骤摘要】
LAMP检测玉米MlR162的引物组、试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及转基因植物品系的检测方法，具体涉及LAMP检测玉米MIR162的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
自1996年转基因作物投入商业化种植以来，经济社会效益逐步显现。根据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)的研究报告，2012年全球转基因作物种植面积达到1.7亿公顷，较1996年(170万公顷)增长了 100倍。这些数字反映了全球转基因生物育种的发展态势。但是由于转基因技术可能产生新毒素和过敏原、导致抗性基因的基因漂移等原因，国际社会对转基因食品的安全性仍有相当大的争议。包括我国在内的世界许多国家都出台了转基因产品管理法规，要求对转基因产品进行检测、标识和管理。转基因玉米作为目前世界上最主要的转基因作物之一，占全世界转基因作物种植面积的30%以上，仅次于转基因大豆。自2009年以来，我国进口玉米大幅增长，2012年全年玉米进口 520.74万吨，同比增长197%，主要进口来源地为美国。然而，我国许可进口的转基因玉米品系只有13个。根据我国法律法规，必须对入境玉米进行转基因检测以排除未批准玉米品系进境。MIR162是由先正达公司开发的抗鳞翅目昆虫的转基因玉米，该品系是通过DNA重组技术，将一种来自苏云金芽孢杆菌的抗鳞翅类昆虫的特异性抗虫基因Vip3A导入玉米基因组中。目前Mirl62玉米已经在美国、加拿大、阿根廷、巴西、日本和俄罗斯等国获得了种植批准，并通过了加拿大食品检疫局(CFIA)的安全性审批，但中国农业部并未批准该转基因玉米品系进口。为防止非法转基因生物及其产品在国内种植和销售，对MIR162这种未批准转基因玉米品系的检测十分重要。转基因玉米成分的检测主要采用TaqMan实时荧光PCR方法和普通PCR方法。普通PCR方法由于操作繁琐、耗时长、染料EB有较强毒性、易污染环境等缺点已逐渐被实时荧光PCR检测方法所取代。TaqMan实时荧光PCR灵敏度高、特异性好，但需要荧光PCR仪，设备和试剂成本昂贵，并不普遍适用于检验检疫一线的基层实验室和现场检测。 近年来，环介导等温基因扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,以下简称LAMP)发展迅速。LAMP是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，不需要特殊的试剂和仪器设备，成本低廉，适用于检验检疫一线的基层实验室和现场检测。国内发布的转基因玉米MIR162品系的检测标准是SN/T 1196-2012，国外发布的转基因玉米MIR162品系的检测方法标准是欧盟官方方法“Event-specific method forthe quantification of maize MIR162 by real-time PCR (CRLVL08/08VR) ”，这两个标准均采用实时荧光PCR方法。其他研究包括:(I)邓婷婷等2012年发表了“转基因玉米MIR162品系的实时PCR及可视芯片检测方法研究”(植物检疫，2012，26(5)，14-18)。(2)Jae_Hwan Kim等2009年发表了利用多重PCR检测四个转基因玉米品系(3272、LY038、MIR162和M0N88017)的方法(J.Korean Soc.Appl.Biol.Chem.2009，52(1)，105-107)。(3)路兴波等申请了专利“用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物、探针及其应用”(CN201210053592)和“用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及荧光标记探针及其应用”(CN201210052534)。这些研究全部采用的普通PCR方法和荧光PCR方法。目前尚未发现将LAMP应用于转基因玉米MIR162品系检测的方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速简便、准确灵敏、容易普及、适用基层一线实验室和现场应用的转基因玉米MIR162品系检测方法。为实现上述目的，本专利技术提供一种用于检测转基因玉米MIR162品系的LAMP检测引物组。本专利技术还保护一种用于检测转基因玉米品系MIR162的LAMP检测试剂盒，其特征在于:含有上述引物组。本专利技术还保护一种用于检测转基因玉米品系MIR162的LAMP检测方法，其特征在于:包括使用所述引物组或者所述试剂盒的步骤。所述方法以样品基因组DNA为模板，利用所述引物组或者所述试剂盒进行等温扩增，反应结束后用荧光染料SYBR Green I检测扩增产物，结果判定。本专利技术所采用的技术方案如下: 一种用于转基因玉米品系MIR162检测的LAMP检测引物组，本专利技术通过分析转基因玉米品系MIR162基因序列(HI203349)设计，由外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP和环引物LB组成，所述引物的核苷酸碱基序列分别如下所示: 外引物 F3:5，- ACATGTAATGCATGACGTTAT -3，(SEQ ID No:1) 外引物 B3:5，- GCCTTATCTGTTGCCTTCA -3，(SEQ ID No:2) 内引物FIP:5’ - CGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTC -3’ (SEQ ID No:3)内引物BIP:5’ - AACTAGGATAAATTATCGCGCGCCGGACGTTTTTAATGTACTGAA -3’ (SEQ ID No:4)环引物 LB: 5’ - TGTCATCTATGTTACTAGATCCCCG -3，(SEQ ID No:5) 一种用于转基因玉米品系MIR162检测的LAMP检测试剂盒，含有权利要求1所述引物组的试剂盒。一种用于转基因玉米品系MIR162检测的LAMP检测方法，包括如下步骤: (1)根据上述引物的核苷酸序列信息合成外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP和环引物LB，分别配制成浓度为10 Mmol/L的外引物F3溶液、10 Mmol/L的外引物B3溶液，40 Mmol/L的内引物FIP溶液、40 Mmol/L的内引物BIP溶液、40 Mmol/L的环引物LB溶液作为试剂盒，备用； (2)提取转基因玉米品系MIR162基因组DNA溶液备用； (3)等温扩增反应:以样品基因组DNA为模板，利用所述的LAMP检测引物组进行等温扩增。所述的等温扩增反应体系为25 μ L，即在0.2 mL的PCR反应管中加入:IOXThermoPol 缓冲液 2.5 μL、10 Mmol/L 的外引物 F3 溶液 0.5 μL、10 Mmol/L 的外引物B3溶液0.5 μL、40 Mmol/L的内引物FIP溶液I μL、40 Mmol/L的内引物BIP溶液I μL、40Mmol/L 的环引物 LB 溶液 1 μL、5 mM 甜菜碱 4 μL、10 mM dNTPs 4 μL,100 mmol/L MgSO4 IμL,8υ/μL Bst DNA聚合酶1 μL、基因组DNA溶液2 μ L、6.5 μ L超纯水，混匀后在PCR管盖内壁加 1000XSYBR Green 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测转基因玉米MIR162品系的LAMP引物组，所述引物由外引物F3、外弓丨物B3、内引物FIP、内引物BIP和环引物LB组成，所述引物的碱基序列分别为SEQ ID No:I~5。2.一种用于检测转基因玉米MIR162品系的LAMP检测试剂盒，其特征在于:含有权利要求I所述引物组。3.一种用于检测转基因玉米MIR162品系的LAMP检测方法，其特征在于:包括使用权利要求I所述引物组或者权利要求2所述试剂盒的步骤。4.权利要求3所述检测转基因玉米MIR162品系的LAMP检测方法，其特征在于，以样品基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组或者权利要求2所述试剂盒进行等温扩增，反应结束后用荧光染料SYBR Green I显色，结果判定。5.权利要求4所述检测转基因玉米MIR162品系的LAMP检测方法，其特征在于，所述PCR扩增中的反应体系为25 yL，即在0.2 mL的PCR反应管中加...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈双雅，王嘉鹤，刘棠，彭小莉，许秋贝，张永祥，
申请(专利权)人：陈双雅，
类型：发明
国别省市：
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