人疱疹病毒ebv和vzv检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒，由定量PCR反应液、EBV标准品、VZV标准品、EBV阳性对照品、VZV阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、EBV上游扩增引物、EBV下游扩增引物、VZV上游扩增引物、VZV下游扩增引物、EBV荧光探针和VZV荧光探针。本发明专利技术试剂盒采用实时荧光定量PCR技术和双色荧光探针，能一步法检测人疱疹病毒EBV和VZV，实现了EBV和VZV感染的同步诊断，对阳性病毒能实时准确定量，可满足临床早期、准确诊断EBV和VZV感染的迫切需要，为EBV和VZV感染的及时针对性治疗提供依据。

【技术实现步骤摘要】
人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒
本专利技术属生物
，涉及荧光定量PCR检测试剂盒，具体涉及一种双探针实时荧光定量PCR同时检测患者血液、尿液、脑脊液等样本中爱泼斯坦一马尔病毒(Epstein-Barr virus, EBV)和水痘一带状疱疫病毒(varicella-zoster virus, VZV)的诊断试剂盒。
技术介绍
EBV和VZV是引起儿童病毒性脑炎的常见人疱疹病毒。EBV侵犯中枢神经系统后，可导致脑水肿、出血、免疫复合物沉积、脑组织脱髓鞘样改变等，临床可表现为急性起病或慢性活动性损害。急性EBV脑炎多为病毒直接侵入神经系统，如脑膜、脑组织和脊髓、外周神经多个部位的神经轴索；慢性EBV脑炎则与自身免疫反应有关，为免疫复合物的沉积、感染后炎性反应造成的脑组织脱髓鞘样改变。VZV初次感染引起水痘，主要发生于儿童；水痘痊愈后病毒潜伏于神经节细胞，再激活引起带状疱疹。VZV脑炎常发生于出疹后I周内，其发病机制可能为病毒直接侵犯中枢神经系统，也可能为免疫反应损伤所致。此外，还有同时感染EBV和VZV继发病毒性脑炎的病例报道，两种病毒间可能存在相互促进激活的情况。EBV和VZV感染的早期诊断和及时抗病毒治疗对可明显改善预后，降低病死率。因EBV和VZV感染的临床表现多样，且与其他疱疹病毒相比临床症状和体征多无特异性，因此早期诊断和及时治疗需依赖实验室检测。传统的EBV和VZV检测方法主要包括病毒分离培养和血清学检测，前者曾为疱疹病毒的诊断“金标准”，但存在需时长(3-30天)、敏感性低(尤其在抗病毒药物治疗后)、分型困难等缺陷；后者又分为抗原直接检测法和抗体间接检测法，抗原直接检测法由于某些病毒不产生可检测的抗原而导致敏感性低，抗体间接检测法由于疱疹病毒感染后需I周左右才产生有效浓度的抗体而无法进行早期诊断，且不同疱疹病毒间存在交叉反应，抗体特异性不高。随着分子生物学技术的迅速发展，聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术，特别是近几年兴起的实时荧光定量PCR技术为病原微生物的检测提供了新方向。实时荧光定量PCR技术的基本原理是利用Taq酶的5’_3’外切酶核酸活性，在普通PCR基础上设计荧光双标记探针，两端分别标记荧光报告基团(R)和淬灭基团(Q);探针保持完整时R基团的荧光信号被Q基团抑制，一旦探针被切断，Q基团的抑制作用消失，R基团的荧光信号就可被检测到。该技术通过对荧光信号的检测实现对PCR过程中产物量的实时监测，并可精确计算初始模板量，除具有定量准确、检测快速等优点外，最大的优势是采用完全闭管检测，省去了对PCR产物的后处理，避免了交叉污染。目前的实时荧光定量PCR技术随着材料和仪器的进一步发展，通过在荧光探针的5’端标记不同的荧光染料(FAM、HEX、R0X等)及多通道荧光定量PCR仪，可以实现基因分型、基因突变检测、SNP分析等研究。本专利技术基于上述技术背景，设计针对EBV和VZV的特异性探针，开发能一步法同时检测和定量EBV和VZV的荧光定量PCR试剂盒，旨在满足临床EBV和VZV感染早期、快速诊断的需求，为临床及时进行针对性治疗提供依据。
技术实现思路
本专利技术提供一种人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒，是一种实时荧光定量PCR检测试剂盒，由定量PCR反应液、EBV标准品、VZV标准品、EBV阳性对照品、VZV阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2, dNTPs、耐热DNA聚合酶、EBV上游扩增引物、EBV下游扩增引物、VZV上游扩增引物、VZV下游扩增引物、EBV荧光探针和VZV荧光探针。PCR扩增弓丨物序列为: EBV 上游扩增引物序列(SEQ ID No:1):5’ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3’ ； EBV 下游扩增引物序列(SEQ ID No:2):5，-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’ ； VZV 上游扩增引物序列(SEQ ID No:3):5’ -TAGGCGGATGGTGGACGACT-3’ ； VZV 下游扩增引物序列(SEQ ID No:4):5，-GCCCGCAAACTTGTAGAACTG-3，。EBV 荧光探针序列(SEQ ID No:5):5’ FAM-GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’ ；VZV 荧光探针序列(SEQ ID No:6):5’ HEX-TTGTTATGACGGCCGAGCT-BHQ-1-3’ ； EBV 标准品序列(SEQ ID No:7):GAGCTCCACC CCCTTCATCA GGGTCTTGCC GTCCGTCAGCACCCCCACAT ATCTCTTCTT TGTAATCAGC ATCAGGCAGG AGAAGGTCTT CTCGGCCTCC AGGGAGATGGGGGCCACAAA CAGGCTCCGG GTGGTGTGGG CGGCCAGGGC CTCGGCAAAG CGCAGGGTCT CGCTCTCTGAAAACCCCCGG CACTCGATAA ACAGCGAGTC CGTGTCCCCG TAGATGA ； VZV 标准品序列(SEQ ID No:8·):TAGGCGGATG GTGGACGACT AAGCTCGGCC GTCATAACAAACTTATTAAT ATCCAATTTG GGTGATGTAA TCTGGCGATG TGCATCTGCA ATTATGCGTCCAAACCCGGCCATCCCAGAC GGCATGGCCC GTCTATTCCA TTCAGCAATG GAAACACACG ACGCCTCCGCCGCAGCACGC GAGACGGTGT CGTCATATAA CAACAGTTCT ACAAGTTTGC GGGC。EBV阳性对照和VZV阳性对照分别为EBV和VZV灭活病毒株样品，阴性对照为无菌注射用水样品。本专利技术试剂盒应保存于-20°C，尽量减少反复冻融。本专利技术试剂盒使用方法: 每次检测均应设立阳性对照和阴性对照，标准品用无菌去离子水稀释为IXlO4 -1X IO7拷贝。病毒DNA的提取:严格按照商品化的QIAamp DNA抽提试剂盒操作，从临床标本或病毒分离培养物中提取病毒DNA。PCR扩增检测:在双色(或以上)荧光定量PCR仪上进行，每个PCR反应体系总体积为25 μL,其中包括20 μL PCR反应液和5 μL模板(提取的病毒DNA、标准品、阳性或阴性对照)。探针检测模式为:FAM、HEX通道分别用于检测EBV、VZV0 PCR反应条件:94°C 5分钟预变性，94°C 20秒一60°C 60秒，共40个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。荧光定量结果报告:①检测样品的扩增曲线无对数增长期或双探针CT(threshold cycle)值均> 40为阴性；②检测样品某一探针CT值< 38且扩增曲线有明显对数增长期，则该探针对应的病毒为阳性；同一反应体系中两个探针CT值<38且扩增曲线有明显对数增长期，则为EBV和VZV混合阳性；③检测样品某一探针38 < CT值< 40，需对样本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒，其特征在于，由定量PCR反应液(I),EBV标准品(2 )、VZV标准品(3 )、EBV阳性对照品(4 )、VZV阳性对照品(5 )、阴性对照品(6 )、说明书(7 )和盒体(8 )组成，其中:PCR反应液(I)含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、EBV上游扩增引物、EBV下游扩增引物、VZV上游扩增引物、VZV下游扩增引物、EBV荧光探针和VZV荧光探针； EBV 上游扩增引物序列:5’ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3’ ； EBV 下游扩增引物序列:5，-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’ ； VZV 上游扩增引物序列:5’ -TAGGCGGATGGTGGACGACT-3’ ； VZV 下游扩增引物序列:5’ -GCCCGCAAACTTGTAGAACTG-3’ ； EBV 荧光探针序列:5’ FAM-GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’ ； VZV 荧光探针序列:5’ HEX-TTGTTATGACGGCCGAGCT-BHQ-1-3’ ； EBV 标准品序列:GAGCTCCACC CCCTTCATCA GGGTCTTGCC GTCCGTCAGC ACCCCCACATATCTCTTCTT TGTAAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶然，尚世强，舒强，杜立中，李伟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：