一种利用生物分析仪检测肠炎沙门氏菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用生物分析仪检测肠炎沙门氏菌的方法，包括以下步骤：(1)提取待测肠炎沙门氏菌菌株的DNA；(2)以提取的肠炎沙门氏菌菌株的DNA作为模板进行PCR反应；(3)将凝胶基质与染料混合物按照一定质量比混合均匀，过滤；(4)将凝胶染料混合物注入分离芯片中，将marker加入样品孔中；(5)将步骤(2)中的PCR产物加入样品孔中，将ladder加入指定的ladder孔中；(6)将芯片涡旋混匀后放入生物分析仪中进行自动检测分析。本发明专利技术利用生物分析仪对肠炎沙门氏菌进行快速检测，操作简单快捷，具有较高的灵敏度和准确度，适用性强，有利于大范围的应用推广，对食品安全监测监管具有重大意义。

Method for detecting Salmonella enteritidis by using biological analyzer

The invention discloses a method for using the biological analyzer to detect Salmonella enteritidis, which comprises the following steps: (1) extracted from Salmonella enteritidis strain DNA; (2) to Salmonella enteritidis isolates extracted DNA as template for PCR reaction; (3) the gel matrix and dye mixture according to the a certain ratio of mixing, filtering; (4) the gel dye mixture injection separation chip, marker will be added to the sample hole; (5) the steps of (2) PCR in the products are added to the sample hole, add ladder to the specified ladder Kong Zhong; (6) the chip vortexmixing into biological analyzer in the automatic detection and analysis. The present invention uses biological analyzer for rapid detection of Salmonella enteritidis, simple and quick operation, high accuracy and high sensitivity, strong applicability, application to a wide range, is of great significance for food safety monitoring and supervision.

【技术实现步骤摘要】
一种利用生物分析仪检测肠炎沙门氏菌的方法
本专利技术涉及微生物检测领域，具体涉及一种利用生物分析仪检测肠炎沙门氏菌的方法。
技术介绍
致病菌(Pathogenicbacteria)能引起疾病的微生物称为病原微生物或致病菌。病原微生物包括细菌、病毒、螺旋体、立克次氏体、衣原体、支原体、真菌及放线菌等。一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌。细菌的致病性与其毒力、侵入数量及侵入门户有关。虽然绝大多数细菌是无害甚至有益的，但是相当大一部分可以致病。条件致病菌只在特定条件下致病，如有伤口可以允许细菌进入血液，或者免疫力降低时。例如，金黄色葡萄球菌和链球菌也是正常菌群，常可以存在于体表皮肤，鼻腔而不引起疾病，但可以潜在引起皮肤感染，如肺炎(pneumonia)、脑膜炎(meningitis)和败血症(sepsis)等。沙门氏菌是一种革兰氏阴性短杆菌，不形成芽胞，临床上可表现为胃肠炎、肠热病、菌血症综合征或局灶性疾病。受此菌威胁最大的是婴幼儿、老人及免疫缺陷个体。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。当前，各国政府和学术研究机构都在致力于食品安全问题的研究，食品安全问题受到了空前的关注。生理生化法和血清学法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的检测沙门氏菌的方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。因而，在临床食物中毒时，找到一种快速、简单、准确的检测方法显得非常重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种利用生物分析仪检测肠炎沙门氏菌的方法，可对肠炎沙门氏菌进行快速检测，操作简单快捷，具有较高的灵敏度和准确度，适用性强，有利于大范围的应用推广，对食品安全监测监管具有重大意义。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种利用生物分析仪检测肠炎沙门氏菌的方法，包括以下步骤：(1)提取待测肠炎沙门氏菌菌株的DNA；(2)以提取的肠炎沙门氏菌菌株的DNA作为模板进行PCR反应；(3)将凝胶基质与染料混合物按照一定质量比混合均匀，过滤；(4)将凝胶染料混合物注入分离芯片中，将marker加入样品孔中；(5)将步骤(2)中的PCR产物加入样品孔中，将ladder加入指定的ladder孔中；(6)将芯片涡旋混匀后放入生物分析仪中进行自动检测分析。优选的，步骤(2)中PCR反应所用的引物序列为：Sal-3a：5’-TATCGCCACGTTCGGGCAA-3’；Sal-4a：5’-TCGCACCGTCAAAGGAACC-3’。优选的，步骤(2)中PCR反应条件为：首先，94℃变性3min，之后进行25～30个扩增循环，扩增循环程式设定为94℃变性30s、70℃退火30s、72℃延伸1min。优选的，步骤(2)PCR扩增循环后72℃延伸5min，PCR产物于4℃保存。优选的，步骤(3)中凝胶基质和染料混合物的混合质量比为15:1～20:1。优选的，步骤(3)中凝胶基质与染料混合物混合均匀后，用离心过滤器过滤。优选的，步骤(4)中加入的marker的质量为1-5μL。优选的，步骤(5)中加入的PCR产物的质量与加入的ladder的质量相同。优选的，步骤(6)中的生物分析仪为Agilent2100生物分析仪。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术利用生物分析仪对肠炎沙门氏菌进行快速检测，操作简单快捷，具有较高的灵敏度和准确度，适用性强，有利于大范围的应用推广，对食品安全监测监管具有重大意义。本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。图1为实施例1中11种细菌DNA模板PCR反应的琼脂糖凝胶电泳图，其中，L100为100bpDNAladder，1为肠炎沙门氏菌的电泳结果，2为福氏志贺氏菌的电泳结果，3为宋氏志贺氏菌的电泳结果，4为痢疾志贺氏菌的电泳结果，5为单增李斯特菌的电泳结果，6为威尔氏李斯特菌的电泳结果，7为小肠结肠炎耶尔森氏菌的电泳结果，8为假结核耶尔森氏菌的电泳结果，9为金黄色葡萄球菌金黄色亚种a的电泳结果，10为金黄色葡萄球菌金黄色亚种b的电泳结果，11为金黄色葡萄球菌的电泳结果；图2为实施例1中肠炎沙门氏菌PCR扩增片段在Agilent2100生物分析仪中的凝胶样图，其中，1为肠炎沙门氏菌。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。以下实施例中使用的菌株均通过商购获得，且分别购自CGMCC(中国普通微生物菌种保藏管理中心)和CMCC(中国医学微生物菌种保藏管理中心)，使用的特异性引物序列委托上海英骏生物技术有限公司合成，Agilent2100生物分析仪购自AgilentTechnologies，分离芯片的分离过程在2100生物分析仪上进行，PCR仪购自美国Thermo公司，凝胶成像系统购自美国ULTRA.LUM.Inc。实施例1本实施例提供了一种利用生物分析仪检测肠炎沙门氏菌的方法，包括以下步骤：(1)提取待测肠炎沙门氏菌菌株的DNA；(2)以提取的肠炎沙门氏菌菌株的DNA作为模板进行PCR反应，PCR反应所用的引物序列为：Sal-3a：5’-TATCGCCACGTTCGGGCAA-3’，Sal-4a：5’-TCGCACCGTCAAAGGAACC-3’；PCR反应条件为：首先，94℃变性3min，之后进行25个扩增循环，扩增循环程式设定为94℃变性30s、70℃退火30s、72℃延伸1min，循环后72℃延伸5min，PCR产物于4℃保存。(3)将300μL凝胶基质与20μL染料混合物混合均匀后，用离心过滤器过滤；(4)将凝胶染料混合物注入分离芯片中，将1μLmarker加入样品孔中；(5)取1μL步骤(2)中的PCR产物加入样品孔中，将1μLladder加入指定的ladder孔中；(6)将芯片涡旋混匀后放入Agilent2100生物分析仪中进行自动检测分析。对比例1取5μL步骤(2)中的PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，60V1h，然后照相并观察和分析相应长度的扩增条带。图1为实施例1中11种细菌DNA模板PCR反应的琼脂糖凝胶电泳图，由图1可见，肠炎沙门氏菌菌株出现1条特异条带，而以福氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、单增李斯特菌、威尔氏李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌金黄色亚种a、金黄色葡萄球菌金黄色亚种b和金黄色葡萄球菌DNA作为模板，以Sal-3a、Sal-4a为引物进行扩增时均无特异性条带，表明PCR扩增特异性强。图2为肠炎沙门氏菌PCR扩增片段在Agilent2100生物分析仪中的凝胶样图，由图2可见，利用Agilent2100生物分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用生物分析仪检测肠炎沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测肠炎沙门氏菌菌株的DNA；(2)以提取的肠炎沙门氏菌菌株的DNA作为模板进行PCR反应；(3)将凝胶基质与染料混合物按照一定质量比混合均匀，过滤；(4)将凝胶染料混合物注入分离芯片中，将marker加入样品孔中；(5)将步骤(2)中的PCR产物加入样品孔中，将ladder加入指定的ladder孔中；(6)将芯片涡旋混匀后放入生物分析仪中进行自动检测分析。

【技术特征摘要】
1.一种利用生物分析仪检测肠炎沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测肠炎沙门氏菌菌株的DNA；(2)以提取的肠炎沙门氏菌菌株的DNA作为模板进行PCR反应；(3)将凝胶基质与染料混合物按照一定质量比混合均匀，过滤；(4)将凝胶染料混合物注入分离芯片中，将marker加入样品孔中；(5)将步骤(2)中的PCR产物加入样品孔中，将ladder加入指定的ladder孔中；(6)将芯片涡旋混匀后放入生物分析仪中进行自动检测分析。2.根据权利要求1所述的利用生物分析仪检测肠炎沙门氏菌的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR反应所用的引物序列为：Sal-3a：5’-TATCGCCACGTTCGGGCAA-3’；Sal-4a：5’-TCGCACCGTCAAAGGAACC-3’。3.根据权利要求1所述的利用生物分析仪检测肠炎沙门氏菌的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR反应条件为：首先，94℃变性3min，之后进行25～30个扩增循环，扩增循环程式设定为9...

【专利技术属性】
技术研发人员：董秋月，
申请(专利权)人：杭州更蓝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33