一种以人Ad5复制缺陷型腺病毒为载体的寨卡病毒病疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种能够表达寨卡病毒Env蛋白，并且密码子得到优化的核苷酸序列，所述序列可以与密码子得到优化的寨卡病毒prM蛋白以及prM蛋白内源信号肽融合，插入穿梭载体pDC316后，与辅助载体pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞，包装出以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体的重组腺病毒，所述重组腺病毒载体能够在感染细胞中高效表达寨卡病毒的包膜蛋白。插入所述核苷酸的重组腺病毒作为疫苗单次免疫动物后即可快速诱发强烈的体液免疫和细胞免疫反应。所述重组腺病毒载体寨卡疫苗可以大规模快速制备，能够用于寨卡疫情爆发时大规模人群的应急接种及平时人群的预防性免疫。

A Ad5 vaccine against human adenovirus replication defective adenovirus

The invention discloses a expression of Zika virus Env protein and nucleotide sequence of codons are optimized, the sequence and codon optimized Zika virus prM protein prM protein and endogenous signal peptide fusion, inserted into the shuttle vector pDC316, and the auxiliary carrier pBHGlox_E1,3Cre were co transfected into HEK293 cells, packaging with E1, E3 combined with the lack of replication defective human adenovirus type 5 recombinant adenovirus vector, the recombinant adenovirus vector can efficiently express Zika virus envelope protein in infected cells. The recombinant adenovirus inserted into the nucleotide acts as a vaccine to induce a strong humoral and cellular immune response after a single immunization of the animal. The recombinant adenovirus vector vaccine can be prepared on a large scale and quickly, and can be used for the emergency vaccination of large populations and the prophylactic immunization of the crowd at the time of the outbreak.

【技术实现步骤摘要】
一种以人Ad5复制缺陷型腺病毒为载体的寨卡病毒病疫苗
本专利技术公开了一种以人Ad5复制缺陷型腺病毒为载体的寨卡病毒病疫苗，本专利技术属于生物工程

技术介绍
寨卡病毒(ZikaVirus，ZIKV)是一种单股正链RNA病毒，与黄热病毒(YellowFever)、登革热病毒(DengueFever)、日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)、森林脑炎病毒(Tick-borneencephalitisvirus，TBEV)和西尼罗河病毒(WestNileVirus，WNV)等同属于黄病毒(Flavivirus)科黄病毒属。ZIKV于1947年首次发现于乌干达寨卡森林的猴子身上，主要通过伊蚊传播，少数情况下也可以通过母婴传播、性传播和输血传播。ZIKV最初仅在少数地区有小规模的爆发和流行:1952年，在乌干达、尼日利亚和印度进行的血清流行病学调查显示人类有感染寨卡病毒；1951-1983年，寨卡病毒在非洲和亚洲多个国家传播；2007年，大洋洲的密克罗尼西亚爆发了寨卡疫情，为首次非洲和亚洲之外的爆发；2013-2014年，法属波利尼西亚、复活节岛、库克群岛、法属新喀里多尼亚有疫情的小规模爆发。2015年美洲疫情为首次大规模的寨卡疫情爆发，短时间内便席卷南美，后又扩散至北美和世界其他地区，全球累计有73个国家和地区有疫情报告，根据泛美卫生组织(PanAmericanHealthOrganization，PAHO)的数据，截止2017年3月23日，美洲各地政府累计报告确诊病例1003509例。大部分ZIKV的感染没有明显的症状或者仅有发热、头痛、皮疹、关节痛等轻微症状，这也是之前ZIKV并未受到国际社会重视的原因之一。但在此次美洲疫情的流行中，研究人员发现寨卡感染也能够导致非常严重的疾病：孕妇感染导致的新生儿小头畸形及其他形式的脑部畸形，成年人的Guillain-Barre综合症，近期的研究还发现病毒可以长达半年时间存在于精液等体液中，而且具有传染性；此外，动物模型的研究也发现ZIKV能够损害雄性小鼠的生殖系统。ZIKV基因组的长度在11Kb左右，所编码的10个蛋白被翻译为一条多肽链，然后经由宿主和病毒编码的蛋白酶切割为3个结构蛋白(衣壳蛋白(Capsid，C)、前膜/膜蛋白(Premembrane/Membraneprotein，prM/M)和包膜蛋白(Envelope，E))和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。基于NS5基因序列的遗传分析认为：ZIKV可以分为三个系(Lineage)，东非系、西非系和亚洲系。ZIKV只有一个血清型，因此，单价疫苗即有可能形成针对当前所有毒株的防护。ZIKV与其他黄病毒属的成员具有相似的基因结构和病毒结构，其prM/M蛋白和Env蛋白位于病毒的表面，其中Env蛋白负责病毒与其细胞膜上受体的结合及病毒与细胞膜的融合，是主要的保护性抗原。尽管已经有针对黄热病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒等其他黄病毒属成员的上市疫苗，但到目前为止还没有获得批准的针对ZIKV的疫苗，甚至在2015年南美疫情大爆发之前，科学家对机体应对ZIKV的保护性免疫反应也知之甚少。疫情爆发后，WHO在寨卡疫苗产品特征(TargetProductProfileforZIKVvaccines，TPP)文件中对ZIKV疫苗及疫苗的研发提出了建议和要求。ZIKV疫苗需要满足针对大规模人群进行的应急免疫，需要能够快速产生保护性免疫反应，此外，疫苗的优先人群是怀孕的妇女和育龄妇女，因此，疫苗要有足够的安全性来满足特定人群的需要。目前全世界正在研发的ZIKV疫苗有30多个，仅美国NIH就在2016年获得国会两亿美元的拨款用于多种ZIKV疫苗的研发。根据疫苗平台的不同，在研的ZIKV疫苗主要有五种类型：ZIKV灭活病毒疫苗、ZIKV重组亚单位疫苗、ZIKV减毒疫苗(包括嵌合疫苗)、病毒载体疫苗和核酸疫苗(mRNA/DNA)。每种类型都有各自的优点和缺点：灭活ZIKV疫苗的优点在于安全性高，适合孕妇和儿童等特定人群的使用，之前已经有其它获批的灭活黄病毒类疫苗上市，但缺点在于需要多次免疫才能产生足够的保护性免疫反应，不利于大规模人群应急免疫的使用；重组亚单位疫苗也具有安全性高的优点，但其缺点也在于需要多次免疫，此外，目前尚未有获得批准的黄病毒类重组亚单位疫苗。减毒疫苗的优点在于仅1次免疫就可以产生很高的免疫反应，减毒的黄病毒疫苗已经使用多年，但对于特定人群(孕妇、老人和儿童等免疫低下者)，考虑到其安全性，减毒疫苗要慎用；病毒载体疫苗，如以腺病毒或水泡性口炎病毒为载体的疫苗，具有单次免疫就可迅速产生较高免疫反应的优点，此类疫苗在埃博拉疫苗的研发期间积累了大量的人体安全性数据，尽管目前没有上市的此类疫苗，但其还是具有很高的临床应用前景；核酸疫苗具有制备和储存上简单、快速和稳定的优势，但其缺点在于人体的免疫原性低，目前也没有获批上市的核酸疫苗。在美国，ZIKV的灭活疫苗与核酸疫苗(包括DNA疫苗和mRNA疫苗)已经获得FDA的批准率先进入临床I期的研究，其中DNA疫苗已经于2017年3月份进入临床Ⅱ期的研究。复制缺陷型腺病毒的大规模制备具有成本较低和工艺简单的优点，其宿主范围广、外源蛋白表达水平高、不整合到染色体中，无插入致突变性，因此，近年来越来越多的被应用于基因治疗和疫苗的研发中。本专利技术中使用的AdMax腺病毒系统是由FrankGraham在1999年创建，由加拿大的Micobix公司开发成为一种腺病毒载体包装系统。它本身不具备增殖能力，需要通过重组酶在真核细胞内完成重组出毒，高效且稳定，是目前最方便快捷的腺病毒包装系统之一。虽然AdMax系统具有出毒快，产率高等优点。但作为一种有效的活病毒载体疫苗，除了载体本身的优势，如何使插入的外源目标蛋白更有效地表达至关重要。如果外源蛋白的表达水平过低，需通过增加免疫剂量来获得有效的免疫效果，这样必然会增加载体对接种者的不良影响。因此，通过对目标蛋白的基因进行优化，使其能够更高效的正确表达，是提高疫苗免疫效果的一种有效方法。基于现有
在寨卡病毒病预防接种上的现实需求，及目前现有疫苗在预防效果上效率不高，以及AdMax系统在应用上存在的技术难题，本申请人欲通过对相关蛋白进行密码子优化，并对抗原的表达形式进行合理的设计，使其在真核细胞中的表达量明显增高，并提供具有更强免疫原性，在相同剂量下能够诱导更高水平的抗体的重组腺病毒载体寨卡病毒病疫苗。
技术实现思路
基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种能够表达寨卡病毒Env蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如SEQIDNO:1所示的Env蛋白编码序列。在一个优选的实施方案中，所述核苷酸序列还含有如SEQIDNO:2所示的编码前膜蛋白的核苷酸序列。在一个更为优选的实施方案中，所述编码前膜蛋白的核苷酸序列位于所述核苷酸序列的5’端。在一个尤为优选的实施方案中，在所述编码前膜蛋白的5’端还含有如SEQIDNO:3所示的前膜蛋白内源信号肽密码子优化的核苷酸序列。在一个最为优选的实施方案中，所述核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，所述核苷酸序列表达出的融合多肽为ZIK本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够表达寨卡病毒Env蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列含有如SEQ ID NO:1所示的Env蛋白编码序列。

【技术特征摘要】
1.一种能够表达寨卡病毒Env蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列含有如SEQIDNO:1所示的Env蛋白编码序列。2.一种能够表达寨卡病毒前膜蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列含有如SEQIDNO:2所示的前膜蛋白编码序列。3.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列同时含有如SEQIDNO:2所示的编码前膜蛋白的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于，所述编码前膜蛋白的核苷酸序列位于所述核苷酸序列的5’端。5.根据权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于，在所述编码前膜蛋白的5’端还含有如SEQIDNO:3所示的前膜蛋白内源信号肽密码子优化的核苷酸序列。6.根据权利要求5所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。7.一种含有如权利要求1、3-6任一所述核苷酸序列的穿梭质粒载体，其特征在于，所述载体为pDC316。8.一种能够表达如权利要求1、3-6任一所述核苷酸序列的人复制缺...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈薇，郭强，侯利华，吴诗坡，宋小红，付玲，王步森，张金龙，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11