一种TIGR调控的甲羟戊酸途径制造技术

本发明专利技术属于生物化学领域，涉及一种利用TIGR(可调控基因区域)调控MEV(甲羟戊酸)途径，生产异戊烯类化合物，尤其是玉米黄素。具体地，将外源MEV途径引入到产玉米黄素的工程大肠杆菌(ZEAX)中，尤其是引入TIGR调控的MEV的上游途径和下游途径，以协调中间产物的产生，减小中间产物积累对细胞产生毒性，最终提高玉米黄素的产量。

A TIGR regulated approach to the hydroxyl amino acid pathway

The present invention belongs to the field of Biochemistry, and relates to the regulation of MEV (hydroxymethyl acid) pathway by TIGR (which can regulate gene region) and production of Isoamyl compounds, in particular zeaxanthin. Specifically, the exogenous MEV pathway into engineering Escherichia coli for production of zeaxanthin (ZEAX), especially the upstream and downstream pathways regulated by TIGR pathway into MEV, to coordinate the intermediate product, reduce the accumulation of intermediate products toxic to cells, and ultimately improve the yield of zeaxanthin.

【技术实现步骤摘要】
一种TIGR调控的甲羟戊酸途径
本专利技术属于生物化学领域，具体涉及利用大肠杆菌重组工程菌，生产玉米黄素。
技术介绍
玉米黄素是一种高价值的类胡萝卜素，除用作保健品，化妆品，食物等，临床上还广泛用于治疗老年性黄斑病变。随着玉米黄素的市场需求不断扩大，原玉米黄素的生产方式(化学合成和直接从植物提纯)难以稳定的供给市场。因此，急需要提高玉米黄素的产量。目前已有多个课题组报道了可用工程大肠杆菌来生产玉米黄素(Albrechtetal.BiotechnolLett1999,21(9):791–795；Nishizakietal.,ApplEnvironMicrobiol2007；73(4):1355–1361；Lietal.,JIndMicrobiolBiot.2015,42,627-636)。其中Lietal.报道的工程大肠杆菌的玉米黄素产量最高，达到11.95mg/gDCW(菌干重)。利用大肠杆菌生成玉米黄素，通常是先合成中间物质IPP(异戊二烯焦磷酸)，再生成玉米黄素。IPP(异戊二烯焦磷酸)为不仅为玉米黄素的前体,还是许多萜类化合物的前体，如番茄红素、胡萝卜素、玉米黄素、虾青素等类胡萝卜素，柠檬烯和蒎烯等单萜化合物，发呢烯、没药烯和紫穗槐-4,11-二烯等类倍半萜类化合物，紫杉烯等双萜类化合物等。大肠杆菌由糖酵解途径中间产物3-磷酸甘油醛和丙酮酸缩合通过DXP途径(图1)来合成IPP。而一些真核细胞如酵母，则是通过甲羟戊酸(MEV)途径(图1)来合成IPP。本领域人员研究发现，在大肠杆菌中引入酿酒酵母的MEV途径，能够增加IPP的供给，从而提高目标产物异戊烯类化合物的生产效率。然而，他们所引入的MEV途径并没有考虑途径内每个基因间的协调表达问题，MEV途径内基因间表达不协调导致MEV途径中间产物积累，对细胞产生毒性。目前为止，也没有将MEV途径引入大肠杆菌，用于生产玉米黄素。TIGR(tunableintergenicregions，可调基因区域)是基因与基因间一段的非编码序列，利用TIGR，可以同时协同多个基因的表达。Pfleger等报道了一种TIGR(可调基因间隔区)代谢通道技术，即在两个基因间插入TIGR能很好地协调基因的表达，他们利用该技术对酿酒酵母MEV上游途径的基因间插入了TIGR后，使其合成甲羟戊酸的量提稿7倍(NatureBiotechnology2006,24:1027-1032)。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种TIGR调控MEV途径的重组基因片段，利用该重组基因片段可以提高IPP产量。本专利技术的目的还在于提供一种含有上述重组片段的产玉米黄素大肠杆菌，利用所述的大肠杆菌可以提高玉米黄素的产量。本专利技术的目的通过以下技术手段实现：本专利技术提供了一种TIGR序列。所述序列选自如SEQIDNo.3所述的TIGR3序列或如SEQIDNo.4所述的TIGR4序列。本专利技术提供了一种TIGR调控MEV途径的重组基因片段。所述的MEV途径包括MEV上游途径基因和MEV下游途径基因。所述的MEV上游途径基因包括：atoB：乙酰辅酶A乙酰转移酶基因；HMGS：羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因；HMGR：羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因；所述的MEV上游途径基因atoB与HMGS间插有TIGR1序列，HMGS与HMGR之间插有TIGR2序列。所述的TIGR1如SEQIDNo.1所示；所述的TIGR2如SEQIDNo.2所示；所述的MEV下游途径基因包括：MK：甲羟戊酸激酶基因；PMK：磷酸甲羟戊酸激酶基因；MVD：焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因。所述的MEV下游途径基因MK与PMK间插有TIGR3序列，PMK与MVD之间插有TIGR4序列。所述的TIGR3如SEQIDNo.3所示；所述的TIGR4如SEQIDNo.4所示。所述TIGR序列既可以经全合成，也可以采用Pfleger等报道的文库方法筛选得到(NatureBiotechnology2006,24:1027-1032)。本专利技术提供的TIGR调控MEV途径的重组基因片段还包含启动子P1。所述的启动子P1可以是P37、PgadE、Ptrc、Ptac、PBAD和PlacUV5等大肠杆菌启动子；优选地，为PgadE。本专利技术提供的TIGR调控MEV途径的重组基因片段还包含idi和ispA基因。本专利技术提供的TIGR调控MEV途径如图2所示。所述的MEV途径的第一个基因atoB来自大肠杆菌；其他基因(atoB、HMGS、HMGR、MK、PMK、MVD、idi、ispA)可来自于酿酒酵母、也可以来其他微生物，如金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、博德特氏菌(Bordetellapetrii)、食酸戴尔福特菌(Delftiaacidovorans)和甲羟戊酸假单胞菌(Pseudomonasmevalonii)等。既可以是天然基因、也可以是其突变基因。既可以全部来自于一种上述微生物、也可以来自上述两种或多种微生物的组合。在本专利技术的实施例中MK、PMK和MVD均选自酵母菌，分别为ERG12，ERG8和ERG19。利用本专利技术的TIGR调控MEV途径的重组基因片段，可用于产IPP为前体的异戊烯类化合物的大肠杆菌，包括番茄红素、胡萝卜素、玉米黄素、虾青素等类胡萝卜素，柠檬烯和蒎烯等单萜化合物，发呢烯、没药烯和紫穗槐-4,11-二烯等类倍半萜类化合物，紫杉烯等双萜类化合物等。在本专利技术优选的实施例中，用于生产玉米黄素。本专利技术提供了一种含TIGR调控MEV途径的重组基因片段的质粒制备方法，具体如下：S1.TIGR调控的MEV上游途径的构建1)以F1/F2为引物、大肠杆菌EscherichiacoliDH5基因组为模板，PCR扩增atoB基因，连接到pBAD33载体上，得到pBAD33-atoB；2)以F3/F4为引物、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因组为模板，PCR扩增HMGS基因，连接到pMD18-T载体上，得到pMD-HMGS；3)以F5/F6为引物、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因组为模板，PCR扩增tHMGR基因，连接到pMD18-T载体上，得到pMD-tHMGR；4)以F7/F8为引物、pMD-HMGS为模板，PCR扩增；以F9/F6为引物、pMD-tHMGR为模板，PCR扩增；5)以F7/F6为引物、上一步胶回收的2个PCR片段为模版，PCR扩增，连接到pBAD33-atoB的SmaI/PstI间，得到pBAD33-MevTTIGR。6)NheI/PstI酶切pBAD33-MevTTIGR，连接到pZSBP的相应酶切位点间，得到pZS-MevTTIGR.SEQIDNO.5F1:GCTGAGCTCTTTCGGAATTAAAGGAGCATCAAATATGAAAAATTGTGTCATCGTCAG(SacI)SEQIDNO.6F2:GATCCCGGGTTAATTCAACCGTTCAATCACC(SmaI)SEQIDNO.7F3:TCAGGATACAGTATCTGCGGTACCGGAGGACAGCTAAATGAAACTGTCCACTAAACTGTSEQIDNO.8F4:GGGTGGTCGCGCACC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种TIGR序列，选自如SEQ ID No.3所述的TIGR3序列或如SEQ ID No.4所述的TIGR4序列。

【技术特征摘要】
1.一种TIGR序列，选自如SEQIDNo.3所述的TIGR3序列或如SEQIDNo.4所述的TIGR4序列。2.一种TIGR调控MEV途径的重组基因片段，其特征在于包含TIGR调控MEV上游途径基因和MEV下游途径基因；所述的MEV上游途径基因包含：atoB，HMGS，HMGR；所述atoB与HMGS间插有TIGR1序列，HMGS与HMGR之间插有TIGR2序列；所述的TIGR1如SEQIDNo.1所示；所述的TIGR2如SEQIDNo.2所示；所述的MEV下游途径基因包括：MK，PMK，MVD；所述的MK与PMK间插有TIGR3序列，PMK与MVD之间插有TIGR4序列。3.如权利要求1所述的重组基因片段，其特征在还包含启动子P1，所述的启动子P1选自大肠杆菌启动子P37、PgadE、Ptrc、Ptac、PBAD、PlacUV5中的一种；优选地，为PgadE。4.如权利要求1所述的重组基因片段，...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛珉，刘建忠，
申请(专利权)人：辛珉，
类型：发明
国别省市：广东,44