β‑1,4‑异木聚糖、其硫酸化衍生物及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供一种从铁皮石斛中获得的β‑1,4‑异木聚糖、其硫酸化衍生物及其制备方法和用途。具体而言，采用氢氧化钠提取铁皮石斛中粗多糖，再经醇沉，结合多种柱层析与酶法纯化，经鉴定得到均一的β‑1,4‑异木聚糖。使所述β‑1,4‑异木聚糖硫酸化得到其硫酸化衍生物。体外药理实验证明，β‑1,4‑异木聚糖的硫酸化衍生物可在低浓度下显著抑制血管生成，且几乎没有毒性，有望被开发成为无毒高效的抗血管生成类药物。

Beta 1,4 trees, sulfated derivatives of chitosan and its preparation method and application thereof

The present invention provides a gain from Dendrobium 1,4 beta trees, sulfated derivatives of chitosan and its preparation method and application thereof. Specifically, using sodium hydroxide extraction of crude polysaccharide from Dendrobium candidum, followed by ethanol precipitation, combined with a variety of column chromatography and enzyme purification method, identified homogeneous beta 1,4 rare chitosan. The beta 1,4 rare sulfated chitosan and its sulfated derivatives. That pharmacological test in vitro, sulfated derivatives of beta 1,4 rare chitosan can significantly inhibit angiogenesis in low concentrations, and almost no toxicity, are expected to be developed as efficient and non-toxic anti angiogenesis drugs.

【技术实现步骤摘要】
β-1,4-异木聚糖、其硫酸化衍生物及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种中草药多糖及其制备方法，更具体地说，涉及一种铁皮石斛β-1,4-异木聚糖、其硫酸化衍生物以及它们的制备方法及所述硫酸化衍生物在抗血管生成方面的应用。
技术介绍
道家经典《道藏》曾把铁皮石斛列为“中华九大仙草之首”，主要分布在浙江、安徽、云南等地。它的干燥茎具有滋阴养胃，增强免疫力，调节血糖水平等的功效。早期研究表明，多糖是一种重要的活性物质，多糖的含量也间接反映药材品质。因此，对石斛多糖的定性研究不仅可以为石斛品种鉴别提供依据还可以规范中药市场。前期研究主要集中在水提多糖，因为铁皮石斛多糖的分离纯化及结构解析仍然面临很多挑战，迄今为止从铁皮石斛中只获得少数水提均一多糖。然而，对铁皮石斛碱提多糖知之甚少。作为碱提多糖中重要的组成成分之一的木聚糖是一种重要的复杂多糖，不同来源的木聚糖之间也存在着很大的区别。因此，它的结构也可以作为品种鉴定的参考指标之一。更重要的是，功能性木聚糖衍生物作为新一代的生物制品具有广泛的药理活性。与其它衍生物相比，硫酸化多糖则具有更强的生物活性。硫酸化多糖具有多种生物活性，如抗凝、抗补体、抗肿瘤和抗血管生成等活性。血管生成在机体中发挥着重要的作用。研究表明，血管生成不直接引发肿瘤，但是可以促进恶性肿瘤发展和转移。血管生成虽然有益于机体器官的生长和修复，但是也可以为肿瘤细胞的生长提供条件并引起恶性疾病和炎症。如今，越来越多的证据表明，抗血管生成的化合物也可以阻止肿瘤的发展。抗血管生成方面的研究很有可能改变临床抗肿瘤药物的现状，肿瘤患者也将受益于抗血管生成疗法。在大量生物活性筛选的基础上，出现越来越多抗血管生成化合物。研究发现，硫酸化多糖具有较强的抑制血管生成的活性。虽然一些硫酸化多糖具有良好的生物活性，但同时也表现出不可忽略的细胞毒性。因此，具有合适的取代度，无细胞毒性的抗血管生成硫酸化多糖有望被开发成为抗血管生成类抗肿瘤药物的候选药物，在肿瘤治疗候选药物上方面具有巨大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种无细胞毒性并且具有抗血管生成活性的药物。一方面，本专利技术提供一种β-1,4-异木聚糖(下文中称为：S32)，其结构式如下：其中，Rx为α-L-Araf-(1→4)-α-D-Glcp-(1→；β-D-Xylp-(1→；α-L-Araf-(1→，或β-D-Galp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→，n＝3-42，并且优选地，n＝19-21。其中，所述β-1,4-异木聚糖的尖峰分子量为：3.7×104Da。另一方面，本专利技术提供所述β-1,4-异木聚糖的制备方法，该方法包括以下步骤：a.多糖提取：铁皮石斛干燥茎经脱脂后，用碱提取，经醇沉洗涤后得到粗多糖DOA；b.多糖纯化：得到的粗多糖DOA经阴离子交换柱分离、去除淀粉后，经凝胶柱纯化得到S32。具体地，所述方法包括以下步骤：a.多糖提取：铁皮石斛干燥茎经95％乙醇浸泡脱脂，风干，粉碎后沸水反复提取10次。过滤后残渣用浓度为0.1-2M，优选的浓度值为1M的氢氧化钠溶液提取，滤液用盐酸中和后浓缩，透析，透析内液经离心，5倍体积的95％乙醇沉淀，离心后经无水乙醇和丙酮交替洗涤3次后干燥得到铁皮石斛碱提粗多糖DOA；b.多糖纯化：取铁皮石斛碱提粗多糖，去离子水溶解，离心，上清液经DEAESepharosefastflow阴离子交换柱分离；采用硫酸-苯酚法检测，收集0.1M氯化钠洗脱组分DOA1；进一步采用α-淀粉酶除去DOA1中的淀粉得到DOA1a，产物进一步用SephacrylTMS-300纯化得到S32。对通过以上方法得到的β-1,4-异木聚糖进行结构鉴定：经高效凝胶渗透色谱(highperformancegelpermeationchromatography，HPGPC)法测定，S32多糖相对分子质量为3.7×104Da。间苯基苯酚法测定结果显示S32的糖醛酸含量为15.0％。采用0.05M三氟乙酸(TFA)将S32部分酸水解后得到次级多糖S3205I。还原前后及水解前后对多糖的单糖组成和甲基化分析。综合对S32多糖、还原的以及部分酸水解的次级多糖的单糖组成，甲基化、红外以及核磁共振数据解析，确定S32含有木糖、4-甲氧基-葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、葡萄糖以及痕量的半乳糖和鼠李糖，其对应的比例为62.7:12.3:8.9:8.5:3.7:3.9。S32以1,4-β-D-吡喃木糖为主链结构，C-2位上有分支。分支主要由末端连接的α-L-呋喃阿拉伯糖、4-甲氧基-α-D-吡喃葡萄糖醛酸、少量β-D-吡喃半乳糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖、末端连接的β-D-吡喃木糖以及α-L-呋喃阿拉伯糖-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖组成。再一方面，本专利技术提供所述β-1,4-异木聚糖的硫酸化衍生物(下文中称为：S32S)的制备方法，该方法包括以下步骤：1)采用氯磺酸与吡啶制备硫酸化试剂；2)使制得的硫酸化试剂与S32反应，得到S32S。在上述步骤1)中，氯磺酸与吡啶的体积比可为1:1-1:5，例如可为1:3。在上述步骤2)中，反应温度可为40-80℃，例如可为60℃。在一个具体的实施方式中，所述β-1,4-异木聚糖的硫酸化衍生物的制备方法包括以下步骤：向吡啶中逐滴加入氯磺酸制备硫酸化试剂。将S32溶解于甲酰胺中并加入硫酸化试剂使反应。反应结束后用氢氧化钠溶液于冰浴中中和，再用饱和碳酸氢钠透析，接着用去离子水透析。透析内液冷冻干燥后得到淡黄色蓬松硫酸化产物S32S。其中，得到的S32S硫酸化的位点主要为1,4-β-D-吡喃木糖的C-2位或者C-3位，无区域选择性。1,4-β-D-吡喃葡萄糖的硫酸化位点主要发生在C-6位。大部分的4-甲氧基-α-D-吡喃葡萄糖醛酸在C-3位发生了硫酸化取代。少量的1,2,4-β-D-吡喃木糖的C-3位也发生取代。进一步，本专利技术提供一种根据如上所述的方法制备的β-1,4-异木聚糖的硫酸化衍生物。更进一步，本专利技术提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的所述β-1,4-异木聚糖的硫酸化衍生物和药学上可接受的载体。更进一步，本专利技术提供所述β-1,4-异木聚糖的硫酸化衍生物在制备抗血管生成药物中的用途。再进一步，本专利技术提供所述β-1,4-异木聚糖的硫酸化衍生物在制备用于抑制恶性肿瘤的发展和转移的药物中的用途。本专利技术通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本专利技术的内容。附图说明图1为S32的特征高效液相色谱图；图2为S32的特征红外光谱图；图3为S32S的特征红外光谱图；图4为S32的特征13CNMR图谱；图5为S32的特征HMBC图谱；图6为S32S与S32的特征DEPT135NMR图谱，其中，A为S32S的特征DEPT135NMR图谱，B为S32的特征DEPT135NMR图谱；图7为S32及S32S在不同浓度下对人表皮血管内皮细胞HMEC-1在基质胶管腔形成抑制作用的示意图；图8为S32S在不同浓度下对人表皮血管内皮细胞HMEC-1迁移抑制作用的示意图；图9为S32S在不同浓度以及不同处理时间下对LO2细胞(图9A)和HMEC-1细胞(图9B)生长的影响。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术，但这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β‑1,4‑异木聚糖，其结构式如下：

【技术特征摘要】
1.一种β-1,4-异木聚糖，其结构式如下：其中，在上式中，Rx为α-L-Araf-(1→4)-α-D-Glcp-(1→；β-D-Xylp-(1→；α-L-Araf-(1→或β-D-Galp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→，并且n＝3-42，并且优选地，n＝19-21。2.根据权利要求1所述的β-1,4-异木聚糖，其中，所述β-1,4-异木聚糖的尖峰分子量为3.7×104Da。3.一种β-1,4-异木聚糖的制备方法，所述方法包括以下步骤：a.多糖提取：铁皮石斛干燥茎经脱脂后，用碱提取，经醇沉洗涤后得到粗多糖；以及b.多糖纯化：得到的粗多糖经阴离子交换柱分离、去除淀粉后，经凝胶柱纯化得到所述β-1,4-异木聚糖。4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：a.多糖提取：铁皮石斛干燥茎经乙醇浸泡脱脂，风干，粉碎后沸水反复提取，过滤后残渣用浓度为0.1-2M，优选为1M的氢氧化钠溶液提取，滤液用盐酸中和后浓缩，透析，透析内液经离心，乙醇沉淀，离心后经无水乙醇和丙酮交替洗涤后干燥得到铁皮石斛碱提粗多糖；以及b.多糖纯化：取铁皮石斛碱提粗多糖，去离子水溶解，离心，上清液经阴离子交换柱分离，收集洗脱的包含淀粉的多糖组分；进一步除去所述包含淀粉的多糖组分中的淀粉，将得到的产物进一步用凝胶色谱柱纯化得到β-1,4-异木聚糖。5.一种制备如权利要求1所述的β-1,4-异木聚糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁侃，乐晗，刘砚秋，曲欢欢，
申请(专利权)人：中国科学院上海药物研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31