一种采用高效液相色谱法检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法技术

一种采用高效液相色谱法检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法，采用如下色谱条件：氨基色谱柱，紫外检测器，流动相为体积比为40:60～60:40的磷酸盐缓冲溶液与乙腈混合液，其中磷酸盐缓冲溶液浓度为1～4‰，流速0.5～1.5ml/min，柱温20～40℃，检测波长205～215nm，进样量20μl。具有重现性强、灵敏度高、准确度高等优点，可快速、准确地测定维生素C发酵液中葡萄糖酸的含量，为提高“二步发酵法”维生素C生产工艺发酵收率的研究提供指导。

Method for detecting gluconic acid content in vitamin C fermentation broth by high performance liquid chromatography

A method of glucose acid content by high performance liquid chromatography determination of vitamin C in fermentation liquid, the chromatographic conditions: amino column, UV detector, mobile phase volume ratio of 40:60 to 60:40 phosphate buffer and acetonitrile mixture, wherein the phosphate buffer solution concentration of 1 to 4 per thousand, flow rate 0.5 ~ 1.5ml/min, the column temperature was 20 ~ 40 DEG C, the detection wavelength of 205 ~ 215nm, sample volume 20 L, according to: first, for the preparation of inspection of fermentation liquid solution; two, the preparation of the reference solution; three, the donor inspection of fermentation liquid solution into the liquid chromatograph, and control solution according to the the method of chromatographic conditions into the sample, by external standard method for detection of gluconate concentration in fermentation liquid, glucose acid content determination of vitamin C in fermentation broth. This method has strong repeatability, high sensitivity, high accuracy, can the content of Glyconate for rapid and accurate determination of vitamin C in fermentation liquid, provide guidance to improve the study of the \two step fermentation production process of vitamin C fermentation yield.

【技术实现步骤摘要】
一种采用高效液相色谱法检测维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的方法
本专利技术涉及一种检测维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的方法，特别是一种采用高效液相色谱法检测维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的方法。
技术介绍
维生素C又称L-抗坏血酸，是人体必需的维生素，生理作用广泛，在医药和食品工业中均占有重要地位。目前国内普遍采用我国自主研发的“二步发酵法”生产，“二步发酵法”的第一步是单菌发酵，将D-山梨醇转化成L-山梨糖；第二步是混合菌发酵，通过普通生酮基古龙酸菌(俗称小菌)和巨大芽孢杆菌(俗称大菌)的共同作用将L-山梨糖转化成2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。2-酮基-L-古龙酸再经过提取和转化生成维生素C。为改善“二步发酵法”维生素C生产工艺第一、二步发酵效果，研究人员在培养基中加入葡萄糖，但葡萄糖有可能在发酵过程中转化成葡萄糖酸，从而对发酵带来一系列影响，为此需要迅速、准确地测定发酵液中葡萄糖酸的含量，以便采取针对性措施提高改善发酵效果，而“二步发酵法”维生素C生产工艺第一步单菌发酵发酵液中含有山梨醇和山梨糖，第二步混合菌发酵发酵液中含有山梨糖和古龙酸，这些物质与葡萄糖、葡萄糖酸性质相近，分离十分困难，常规的化学分析方法很难快速进行分析测定，因此需要建立一种新的专用检测方法，以快速、准确、方便地测定维生素C发酵液中葡萄糖酸的含量。经检索，未见有专用的、检测维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的方法的公开报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种专用的、采用高效液相色谱法检测维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的方法，以快速、准确、方便地测定维生素C发酵液中葡萄糖酸的含量。本专利技术的目的可以通过这样的技术方案来实现：一种采用高效液相色谱法检测维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的方法，它采用如下色谱条件：色谱柱：氨基色谱柱检测器：紫外检测器流动相：体积比为40:60～60:40的磷酸盐缓冲溶液与乙腈混合液，其中磷酸盐缓冲溶液浓度为1～4‰流速：0.5～1.5ml/min柱温：20～40℃检测波长：205～215nm进样量：20μl是按下列步骤测定维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的：一、制备供检发酵液溶液：精密量取维生素C发酵液Mml，注入容量瓶中，加流动相稀释至10倍体积，摇匀，过滤，制成供检发酵液溶液；二、制备对照品溶液：精密称取葡萄糖酸标准品Nmg，加入容量瓶中，加流动相，溶解摇匀，过滤，制成1mg/ml的液体，作为对照品溶液；三、取供检发酵液溶液注入液相色谱仪，和对照品溶液按照本方法的色谱条件进样，按外标法计算供检发酵液中葡萄糖酸的含量，即得维生素C发酵液中葡萄糖酸的含量。本专利技术所提供的这种检测维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的方法，优选色谱条件：流动相的磷酸盐缓冲溶液浓度为2‰，磷酸盐缓冲溶液与乙腈的体积比为50:50，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为210nm。本专利技术所提供的这种检测维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的方法，程序简单，易操作，由于山梨醇和葡萄糖在本方法中没有响应，不会产生干扰，而山梨糖、古龙酸与葡萄糖酸在本方法中可以得到有效分离，因此具有重现性强、灵敏度高、准确度高等优点，可以快速、准确地测定维生素C发酵液中葡萄糖酸的含量，为提高“二步发酵法”维生素C生产工艺发酵收率的研究提供指导。附图说明图1为在本专利技术实施例的方法色谱条件下，山梨糖、古龙酸与葡萄糖酸的混合液的液相色谱图。具体实施方式为了更好地说明本专利技术，举出以下实施例和验证例，但本专利技术的保护范围并不仅仅局限于此，其要求保护的范围记载于权利要求的权项中。实施例本专利技术实施例提供一种采用高效液相色谱法检测维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的方法，它采用如下色谱条件：色谱柱：LC-NH2250mm×4.6mm色谱柱(氨基色谱柱)检测器：紫外检测器流动相：体积比为50:50的磷酸盐缓冲溶液与乙腈混合液，其中磷酸盐缓冲溶液浓度为2‰流速：1.0ml/min柱温：30℃检测波长：210nm进样量：20μl是按下列步骤测定维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的：一、制备供检发酵液溶液：精密量取三批“二步发酵法”维生素C生产工艺第一步单菌发酵发酵液各1份，各5.0ml；三批“二步发酵法”维生素C生产工艺第二步混合菌发酵发酵液各1份，各5.0ml，注入不同的50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度(50ml)，摇匀，过滤，制成6份供检发酵液溶液；二、制备对照品溶液：精密称取葡萄糖酸标准品50mg，加入50ml容量瓶中，加流动相至刻度(50ml)，溶解摇匀，过滤，制成1mg/ml的液体，作为对照品溶液；三、分别取各供检发酵液溶液注入液相色谱仪，和对照品溶液按照本方法的色谱条件进样，按外标法计算供检发酵液中葡萄糖酸的含量，即得维生素C发酵液中葡萄糖酸的含量，结果见表1。表1：维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的测定结果批号含量(mg/ml)第一批“二步发酵法”维生素C生产工艺第一步单菌发酵发酵液10.18第二批“二步发酵法”维生素C生产工艺第一步单菌发酵发酵液10.43第三批“二步发酵法”维生素C生产工艺第一步单菌发酵发酵液10.21第一批“二步发酵法”维生素C生产工艺第二步混合菌发酵发酵液5.12第二批“二步发酵法”维生素C生产工艺第二步混合菌发酵发酵液5.03第三批“二步发酵法”维生素C生产工艺第二步混合菌发酵发酵液5.23验证例1、分离度色谱条件：同实施例实验方法：精密称取山梨糖、古龙酸、葡萄糖酸标准品各50mg，加入50ml容量瓶中，加流动相至刻度(50ml)，溶解摇匀，过滤，制成山梨糖、古龙酸和葡萄糖酸含量各为1mg/ml的混合液，然后将上述混合液注入液相色谱仪，按照本方法实施例的色谱条件进样，记录色谱图，见附图1，山梨糖色谱峰保留时间为2.72分钟，古龙酸色谱峰保留时间为17.5分钟，葡萄糖酸色谱峰保留时间为19.4分钟，三种物质分离度良好，均在2以上。实验结果表明：在本方法的实施过程中，山梨糖、古龙酸、葡萄糖酸三种物质能够得到有效分离。2、线性试验色谱条件：同实施例实验方法：精密称取葡萄糖酸标准品200mg，加入100ml容量瓶中，加流动相至刻度(100ml)，溶解摇匀，过滤，作为储备液。再向上述储备液中加流动相，按1倍、1.25倍、2倍、4倍、8倍、16倍稀释，分别制成1、2、3、4、5、6号葡萄糖酸标准品溶液，然后分别取各葡萄糖酸标准品溶液注入液相色谱仪，按照本方法实施例的色谱条件进样，以峰面积及浓度作图，进行线性回归，得标准曲线方程，峰面积A＝0.424*C-10.95，相关系数r＝0.9995。实验结果表明：葡萄糖酸在120～2000ug/ml的范围内，峰面积与进样量有良好的线性关系。3、回收率色谱条件：同实施例一、精密量取已知葡萄糖酸含量的“二步发酵法”维生素C生产工艺第一步单菌发酵发酵液6份，各5.0ml，注入不同的50ml容量瓶中，然后再精密称取葡萄糖酸标准品6份，各30mg，分别加入上述的50ml容量瓶中，加流动相至各50ml容量瓶刻度(50ml)，溶解摇匀，过滤，制成1、2、3、4、5、6号供检发酵液溶液；二、精密称取葡萄糖酸标准品50mg，加入50ml容量瓶中，加流动相至刻度(50ml)，溶解摇匀，过滤，制成1mg/ml的液体，作为对照品溶液；三、分别取各供检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用高效液相色谱法检测维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的方法，其特征在于它采用如下色谱条件：色谱柱：氨基色谱柱检测器：紫外检测器流动相：体积比为40:60～60:40的磷酸盐缓冲溶液与乙腈混合液，其中磷酸盐缓冲溶液浓度为1～4‰流速：0.5～1.5ml/min柱温：20～40℃检测波长：205～215nm进样量：20μl是按下列步骤测定维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的：一、制备供检发酵液溶液：精密量取维生素C发酵液M ml，注入容量瓶中，加流动相稀释至10倍体积，摇匀，过滤，制成供检发酵液溶液；二、制备对照品溶液：精密称取葡萄糖酸标准品N mg，加入容量瓶中，加流动相，溶解摇匀，过滤，制成1mg/ml的液体，作为对照品溶液；三、取供检发酵液溶液注入液相色谱仪，和对照品溶液按照本方法的色谱条件进样，按外标法计算供检发酵液中葡萄糖酸的含量，即得维生素C发酵液中葡萄糖酸的含量。

【技术特征摘要】
1.一种采用高效液相色谱法检测维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的方法，其特征在于它采用如下色谱条件：色谱柱：氨基色谱柱检测器：紫外检测器流动相：体积比为40:60～60:40的磷酸盐缓冲溶液与乙腈混合液，其中磷酸盐缓冲溶液浓度为1～4‰流速：0.5～1.5ml/min柱温：20～40℃检测波长：205～215nm进样量：20μl是按下列步骤测定维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的：一、制备供检发酵液溶液：精密量取维生素C发酵液Mml，注入容量瓶中，加流动相稀释至10倍体积，摇匀，过滤，制成供检发酵液溶液；二、制备对照品溶液：精密称取葡萄糖酸标准品Nmg，加入容量瓶中，加流动相，溶解摇匀，过滤，制成1mg/ml的液体，作为对照品溶液；三、取供检发酵液溶液注入液相色谱仪，和对照品溶液按照本方法的色谱条件进样，按外标法计算供检发酵液中葡萄糖酸的含量，即得维生素C发酵液中葡萄糖酸的含量。2.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法检测维生素C发酵液中葡萄糖酸含量的方法，其特征在于它采用如下色谱条件：流动相的磷酸盐缓冲溶液浓度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨剑宇，李迎辉，朱英刚，王俊刚，王清格，王娜，王云，
申请(专利权)人：石药集团维生药业石家庄有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13