一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，提供了一种基于GQDs‑CuO@3D‑rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法及应用。所制备的免疫传感器具有特异性强，灵敏度高和检出限低等优点，对乙肝标志物HBs、HBe的检测具有重要的科学意义和应用价值。

A method of preparation and application of GQDs CuO@3D rGO markers of hepatitis B immune sensor based on

The invention belongs to the nano functional materials, immunoassay, biosensor technology field, provides a method of preparation and application of GQDs CuO@3D rGO markers of hepatitis B immune sensor based on. The prepared immunosensor has the advantages of high specificity, high sensitivity and low detection limit. It has important scientific significance and practical value for the detection of hepatitis B markers HBs and HBe.

【技术实现步骤摘要】
一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法及应用
本专利技术属于新型功能纳米材料、电化学免疫分析和生物传感
，提供了一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法及应用。
技术介绍
HBs、HBe等标志物，对于乙型肝炎的诊断都能起到一定的作用。电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点，在临床检验、环境监测、等领域都有重要的应用价值。GQDs具有良好的导电性、热稳定性、分散性，能增强电子传导，同时具有较大的比表面积、小尺寸效应，以及良好的生物相容性、低毒性，使其能有效吸附固载抗体蛋白。GO表面有大量的羧基官能团，使得他容易与金属氧化物结合。三维石墨烯网3D-rGO能够有效吸附GODs，且其三维形貌具有大的比表面积，增加GODs和CuO的负载量。GODs和CuO对过氧化氢均有催化作用，两者协同作用增加电子传递能力和催化性能，从而获得高强度的检测信号，提高了传感器的灵敏度。GQDs-CuO@3D-rGO通过简单的一步微波方法合成，具有良好的分散性和稳定性，能够紧密结合到巯基乙酸预处理的电沉积金电极上，因此能够保证所构建传感器的稳定性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法及应用，实现了对乙肝标志物的灵敏检测。本专利技术的目的之一是提供一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法。本专利技术的目的之二是将所制备的乙肝标志物免疫传感器，用于检测乙肝标志物。本专利技术的技术方案，包括以下步骤。一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法，包括以下几个步骤：（1）将直径为3~5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）将预处理过的电极浸入10mL、1mmol/L的HAuCl4溶液中，于-0.2V恒定电压下扫描30s，得到电沉积金改性的电极表面，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；（3）将上述步骤（2）处理过的电极浸入10mL、10mmol/L的巯基乙酸TGA中，室温避光反应24h后，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；（4）继续将6µL、2~4mg/mL的GQDs-CuO@3D-rGO溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；（5）继续将6µL、8~12µg/mL的乙肝标志物抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；（6）继续将3µL、1.0~2.0mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；滴加6µL、0.5~120ng/mL的一系列不同浓度的乙肝标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥，制得一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器。一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法，所述GQDs-CuO@3D-rGO的制备，包括以下几个步骤：（1）GO的制备将300~500mLH2SO4/H3PO4(v:v=9:1)的混合液缓慢加入到2~4g石墨粉和16~20gKMnO4的混合物中，室温下搅拌混合，恒温50℃下搅拌反应10~14h，冷却至室温，将反应液倒入350~450mL冰中，加入2~4mL、30%H2O2，20min后，以8000rpm转速离心分离，超纯水洗涤至中性，50℃下真空干燥，制得GO，备用；（2）GQDs的合成将200~300mg研磨过的GO粉末分散于15mL二甲基甲酰胺中，超声分散30min后转移到高压反应釜内，于200℃下反应4~6h，冷却到室温，得到棕色透明悬浮液和黑色沉淀，离心除去黑色沉淀，悬浮液透析纯化，得到GQDs的溶液；（3）GQDs-CuO@3D-rGO的合成将40~60mg的GO分散到50mL乙醇中，超声分散5min；将0.2~0.3gCuCl2·2H2O溶解于10mL超纯水中，得到CuCl2·2H2O水溶液，搅拌下逐滴加入到GO的乙醇分散液中；再逐滴加入0.5~1.5mL的GQDs溶液，搅拌10min后，逐滴加入0.1~0.3mol/L的NH3·H2O，再搅拌10~20min后，鼓风干燥箱中烘干，所得粉末置于微波反应器中加热3~4h，得到GQDs-CuO@3D-rGO。乙肝标志物的检测，步骤如下：（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL、50mmol/L的pH5.10~8.00磷酸盐缓冲溶液中进行测试；（2）用时间-电流法进行检测，输入电压为-0.4V，取样间隔0.1s，运行时间400s；（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10μL、5mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。所述乙肝标志物选自下列之一：HBs、HBe。本专利技术所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。本专利技术的有益成果（1）GODs具有良好的导电性、热稳定性、分散性，能增强电子传导，同时具有较大的比表面积、小尺寸效应，以及良好的生物相容性、低毒性，使其能有效吸附固载抗体蛋白；（2）采用GQDs-CuO@3D-rGO作为捕获乙肝标志物抗体的材料，具有良好的分散性和稳定性，能够紧密结合到巯基乙酸预处理的电沉积金电极上。3D-rGO能够有效吸附GODs，其中三维形貌具有大的比表面积，增加GODs和CuO的负载量，且GODs和CuO对过氧化氢均有催化作用，两者协同作用增加电子传递能力和催化性能，从而获得高强度的检测信号，提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；（3）一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器，对HBs的检测，其线性范围0.5pg/mL～120ng/mL，检测限最低0.17pg/mL；对HBe进行检测，其线性范围为1.0pg/mL~100ng/mL，检测限为0.33pg/mL；表明一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器可以达到准确测定的目的。具体实施方式现将本专利技术通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。实施例1一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法，包括以下几个步骤：（1）将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）将预处理过的电极浸入10mL、1mmol/L的HAuCl4溶液中，于-0.2V恒定电压下扫描30s，得到电沉积金改性的电极表面，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；（3）将上述步骤（2）处理过的电极浸入10mL、10mmol/L的巯基乙酸TGA中，室温避光反应24h后，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；（4）继续将6µL、2mg/mL的GQDs-CuO@3D-rGO溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；（5）继续将6µL、8µg/mL的乙肝标志物抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；（6）继续将3µL、1.0mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于GQDs‑CuO@3D‑rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：（1）将直径为3 ~ 5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）将预处理过的电极浸入10 mL、1 mmol/L的HAuCl4溶液中，于‑0.2 V恒定电压下扫描30 s，得到电沉积金改性的电极表面，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；（3）将上述步骤（2）处理过的电极浸入10mL、10 mmol/L的巯基乙酸TGA中，室温避光反应24 h后，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；（4）继续将6 µL、2 ~ 4 mg/mL的GQDs‑CuO@3D‑rGO溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；（5）继续将6 µL、8 ~ 12 µg/mL的乙肝标志物抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；（6）继续将3 µL、1.0 ~ 2.0 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；滴加6 µL、0.5 ~ 120 ng/mL的一系列不同浓度的乙肝标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥，制得一种基于GQDs‑CuO@3D‑rGO的乙肝标志物免疫传感器。...

【技术特征摘要】
1.一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：（1）将直径为3~5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）将预处理过的电极浸入10mL、1mmol/L的HAuCl4溶液中，于-0.2V恒定电压下扫描30s，得到电沉积金改性的电极表面，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；（3）将上述步骤（2）处理过的电极浸入10mL、10mmol/L的巯基乙酸TGA中，室温避光反应24h后，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；（4）继续将6µL、2~4mg/mL的GQDs-CuO@3D-rGO溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；（5）继续将6µL、8~12µg/mL的乙肝标志物抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；（6）继续将3µL、1.0~2.0mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；滴加6µL、0.5~120ng/mL的一系列不同浓度的乙肝标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥，制得一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器。2.如权利要求1所述的一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法，所述GQDs-CuO@3D-rGO的制备，包括以下几个步骤：（1）GO的制备将300~500mLH2SO4/H3PO4(v:v=9:1)的混合液缓慢加入到2~4g石墨粉和16~20gKMnO4的混合物中，室温下搅拌混合，恒温50℃下搅拌反应10~14h，冷却至室温，将反应液倒入350~450mL冰中，加入2~4mL、30%H2O...

【专利技术属性】
技术研发人员：李月云，姜丽萍，高增强，崔盼盼，张晓波，吕慧，冯金慧，王平，董云会，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37