一种广谱新型嵌合裂解酶GBS-PlySb及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种广谱新型嵌合裂解酶GBS‑PlySb及其编码基因和应用。一种广谱新型嵌合裂解酶GBS‑PlySb，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；一种广谱新型嵌合裂解酶GBS‑PlySb编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术采用基因拼接的手段，构建了一个全新的嵌合裂解酶，可用于杀灭多种链球菌和葡萄球菌，特别是肺炎链球菌、化脓链球菌、猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、变形链球菌、海豚链球菌等以及多种肠球菌和金黄色葡萄球菌；GBS‑PlySb稳定性好，对高浓度的NaCl不敏感，重组蛋白GBS‑PlySb能很好的在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，高剂量的GBS‑PlySb没有明显的细胞毒性。因此，GBS‑PlySb能单独，或者作为添加剂用于多种链球菌的控制以及治疗由这些菌导致的感染，具有广泛的应用前景。

A broad spectrum of novel chimeric GBS lyase PlySb encoding gene and application thereof

The present invention relates to the technical field of gene engineering, in particular to a broad spectrum of novel chimeric GBS lyase PlySb encoding gene and application thereof. A broad spectrum of novel chimeric GBS lyase PlySb, its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO.1; a new broad-spectrum chimeric GBS lyase PlySb encoding gene, the nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.2. The invention adopts the gene splicing method, construct a new chimeric lytic enzyme, can be used to kill a variety of Streptococcus and Staphylococcus aureus, especially Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus, Streptococcus agalactiae, dysgalactiae, Streptococcus mutans, Streptococcus and other dolphins and a variety of Enterococcus and Staphylococcus aureus; GBS PlySb good stability, not sensitive to high concentrations of NaCl, the recombinant protein GBS PlySb well in Escherichia coli BL21 (DE3) expression, the high dose of GBS PlySb had no obvious cytotoxic effect. Therefore, GBS PlySb can alone, or as additives for a variety of control and treatment of streptococcal infection caused by these bacteria, has a wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种广谱新型嵌合裂解酶GBS-PlySb及其编码基因和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种广谱新型嵌合裂解酶GBS-PlySb及其编码基因和应用。
技术介绍
链球菌是一类球形的革兰氏阳性细菌，能引起人和动物的多种疾病。几种主要的链球菌致病菌包括肺炎链球菌、B组链球菌、猪链球菌、变形链球菌、化脓链球菌等。肺炎链球菌是导致大叶性肺炎和婴幼儿支气管肺炎，是院内感染的主要病原菌之一。B组链球菌，尤其是无乳链球菌能导致人和动物的多种感染。在医院内，无乳链球菌能导致孕妇围产期感染，严重威胁新生儿的健康；在养殖业，无乳链球菌能导致多种鱼类的鱼链球菌病，给养殖业造成的损失非常严重。猪链球菌病是一种人畜共患的急性、热性传染病，一旦感染危害非常巨大。变形链球菌是导致口腔龋齿的主要致病菌，目前还没有有效的预防和治疗药物。化脓链球菌则更普遍地分布于自然界，是人类细菌感染中最要的病原之一，能引起各种化脓性炎症，包括猩红热、丹毒、新生儿败血症、脑膜炎以及链球菌变态反应等疾病。由上所述可知，针对链球菌发展新型抗菌药物具有非常重要的意义。噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体感染宿主细菌后晚期表达的一种细胞壁水解酶，用于水解宿主细菌的细胞壁释放子代噬菌体。裂解酶通常具有模块化的结构，即包括N-端的催化功能域(CD)和C-端的细胞结合功能域(CBD)。这两个功能域相对独立，具有比较明确的功能。CD功能域主要体现为肽聚糖水解活性，而CBD功能域则具有与特定把细菌特异性识别的功能。基于这两者的功能上的差异，可以将不同来源的裂解酶的CD与CBD组合发展具有新功能的嵌合裂解酶。这种构建策略是目前裂解酶分子体外定向进化的一种有力工具，但是否将任意一个蛋白质的催化结构域和另外一个蛋白质的结合结构域融合在一起就可以获得一个新的有杀菌活性和新功能的裂解酶是不可预测的，且大多数随机组合所得到的都是没有活性、或者活性很低的裂解酶。如DanielA等人通过人工设计才从7种不同的组合中筛选出1种有杀菌活性的裂解酶(ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,Apr.2010,p.1603–1612)。裂解酶由于具有较强的裂解活性和极低的耐药性，是一种潜在的抗菌分子。但是，由于裂解酶具有较强的宿主选择性，通常具有较窄的裂解谱，不能满足细菌混合感染的需求。因此，开发具有广谱裂解活性的嵌合裂解酶对于满足临床上治疗、控制细菌混合感染的需求、发展新的抗菌药物具有非常重要的意义。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种广谱新型嵌合裂解酶GBS-PlySb，此裂解酶具有能采用大肠杆菌可溶性表达，酶活性高，能广谱杀灭链球菌的优点，可应用于制备体内、体外抗感染药物；本专利技术的另一目的是提供上述广谱的新型嵌合裂解酶GBS-PlySb的应用。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种广谱新型嵌合裂解酶GBS-PlySb，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。一种广谱新型嵌合裂解酶GBS-PlySb的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。一种广谱新型嵌合裂解酶GBS-PlySb的应用，所述广谱新型嵌合裂解酶GBS-PlySb应用于动物和人体外及体内杀灭链球菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌。进一步地，所述的链球菌包括肺炎链球菌、化脓链球菌、猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、变形链球菌、海豚链球菌。进一步地，所述广谱新型嵌合裂解酶GBS-PlySb作为有效成份应用于制备抗链球菌感染、肠球菌或金黄色葡萄球菌药物。进一步地，所述的药物为预防与治疗奶牛乳腺炎、鱼链球菌病、猪链球菌病以及龋齿的药物。有益效果：本专利技术公开的广谱新型嵌合裂解酶GBS-PlySb可用于杀灭多种链球菌和葡萄球菌，特别是肺炎链球菌、化脓链球菌、猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、变形链球菌、海豚链球菌等以及多种肠球菌和金黄色葡萄球菌；GBS-PlySb稳定性高，对高浓度的NaCl不敏感，重组蛋白GBS-PlySb能很好的在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，高剂量的GBS-PlySb没有明显的细胞毒性。因此，GBS-PlySb能单独，或者作为添加剂用于多种链球菌的控制以及治疗由这些菌导致的感染，具有广泛的应用前景。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为GBS-PlySb基因PCR扩增结果图；图2为GBS-PlySb杀灭停乳链球菌标准菌株ATCC35666的时间变化结果图；图3为GBS-PlySb体外杀灭链球菌、葡萄球菌等不同菌株广谱性的结果图；图4为GBS-PlySb酶在不同NaCl浓度下杀灭停乳链球菌ATCC35666的活性结果图；图5为GBS-PlySb酶在不同pH时杀灭停乳链球菌ATCC35666的活性结果图；图6为GBS-PlySb酶在不同EDTA浓度下杀灭停乳链球菌ATCC35666的活性结果图；图7为GBS-PlySb酶在不同温度下杀灭停乳链球菌ATCC35666的活性结果图；图8为GBS-PlySb酶对于细胞毒性的测试结果图；图9为牛奶中GBS-PlySb酶杀灭停乳链球菌ATCC35666的结果图；图10为血清中GBS-PlySb酶杀灭停乳链球菌ATCC35666的结果图；图11为GBS-PlySb酶与其它嵌合裂解酶的活性比较的结果图。具体实施方式展示一下实例来具体说明本专利技术的某些实施例，且不应解释为限制本专利技术的范围。对本专利技术公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本专利技术的的精神和范围之内。实施例1：广谱链球菌嵌合裂解酶的构建1.PlyGBS的催化域、PlySs2的细胞壁结合域的制备全序列合成裂解酶PlyGBS和裂解酶PlySs2(南京金斯瑞生物技术有限公司)，合成序列装入pUC57质粒中。以plyGBS基因为模板，GBS180-F/GBS180-R为引物，扩增得PlyGBS的催化域GBS180的序列，以plySs2基因为模板，PlySb-F/PlySb-R为引物，扩增得PlySs2的细胞壁结合域。克隆构建中所用到的引物和酶切位点信息如下：GBS180-F:5-TTAACCATGGGCATGGCTACCTACCAGG-3GBS180-R:5-TATAGGATCCGATCGTTTTGGTCGTGC-3PlySb-F:5-TATAGGATCCTCTCGTTCCTATCGCGAG-3PlySb-R:5-TATACTCGAGTTTAAATGTACCCCAAG-3GBS180-F引物下划线标注的是限制性内切酶NcoI位点，GBS180-R和PlySb-F引物下划线标注的是限制性内切酶BamHI位点，PlySb-R引物下划线标注的是限制性内切酶XhoI位点。PCR扩增基因片段的程序如下：以2μL基因为模板，各加入引物1μg进行PCR扩增，PCR反应条件为：(1)94℃预变性5min；(2)94℃变性30sec，62℃，45sec，72℃，45sec，30个循环；(3)72℃延伸10min。2.可溶表达GBS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种广谱新型嵌合裂解酶GBS‑PlySb，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种广谱新型嵌合裂解酶GBS-PlySb，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的一种广谱新型嵌合裂解酶GBS-PlySb的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.如权利要求1所述的一种广谱新型嵌合裂解酶GBS-PlySb的应用，其特征在于：所述广谱新型嵌合裂解酶GBS-PlySb应用于动物和人体外及体内杀灭链球菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌。4.根据权利要求3所述的一种广谱新型嵌合裂解酶GBS-Pl...

【专利技术属性】
技术研发人员：危宏平，杨航，洪伟，卢刚，
申请(专利权)人：武汉赛思锐微生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42