一种黄曲霉无毒株及其防治黄曲霉污染的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种黄曲霉无毒株及其防治黄曲霉污染的应用，所述的无毒株中黄曲霉不表达致病相关基因

Aflatoxin avirulent strain and its application for preventing and treating aflatoxin pollution

The present invention discloses one kind of aflatoxin avirulent strain and its application for preventing and curing aflatoxin pollution, and aflatoxin in the avirulent strain does not express pathogenic related gene

【技术实现步骤摘要】
一种黄曲霉无毒株及其防治黄曲霉污染的应用
本专利技术属于微生物学领域，具体涉及一种黄曲霉无毒株及其防治黄曲霉污染的应用。
技术介绍
黄曲霉（Aspergillusflavus）是广泛分布于自然界的腐生真菌，生长和扩散能力极强。黄曲霉可以寄生于粮食、食品及饲料中进行生长繁殖，并产生黄曲霉毒素，其中以黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）的危害最大，具有强肝脏毒性和致癌效应。目前全球每年有25%农作物被霉菌毒素污染，其中最为严重的就是黄曲霉毒素的污染。我国花生和玉米被黄曲霉污染的情况比较普遍，畜禽饲料和水产饲料的黄曲霉污染则更为严重，结果导致黄曲霉毒素通过食物链危害人类健康。由于黄曲霉毒素的理化性质稳定，大规模工业加工、日常烹饪条件或者巴氏灭菌等都无法清除污染。因此黄曲霉污染危害巨大，研究预防和控制黄曲霉污染具有重大的意义。黄曲霉菌丝生长、产孢，和产毒等的能力与其扩散、繁殖和毒力密切相关，直接影响黄曲霉的致病性，一直以来科学家围绕黄曲霉致病性调控机理展开了大量研究。随着黄曲霉全基因组测序的完成，对其致病性相关的遗传因素筛查和研究日渐增多，然而目前发现即使完全相同遗传背景下，黄曲霉的产毒量也可能差异极大。这就提示黄曲霉对非遗传因素的影响非常敏感。这其中有关外界环境因子如营养、温度、水活度、pH值、氧化状态以及群体感性等影响黄曲霉形态和产毒的研究已开展多年，而关于体内非遗传因素调控黄曲霉致病性研究则仍处在起步阶段。研究发现真菌的次级代谢相关基因的转录和表达极有可能受到组蛋白乙酰化、DNA甲基化等表观遗传因素调控。这些表观遗传修饰被认为可能是联接遗传背景、环境因子两大因素的重要桥梁之一，介导两者的复杂交互作用，最终影响生物的性状。在稻瘟病菌中对Ash1样的蛋白-MoKMT2H的研究发现该基因直接调控稻瘟病菌的孢子萌发和该菌对水稻的毒力。黄曲霉中还未见关于Ash1（Aflash1）介导的组蛋白甲基化修饰的研究报道，Aflash1介导的表观遗传修饰对黄曲霉的致病性是否有影响也是未知的。本专利技术人经过广泛研究，通过生物信息学分析首次在黄曲霉中找到一个假定ash1基因，本专利技术人通过western-blotting分析，确定该基因确实具有组蛋白甲基化转移酶的生物学功能，于是将之命名为aflash1基因。因此，本专利技术公开了一种黄曲霉无毒株⊿Aflash1菌株，该无毒株中黄曲霉不表达致病相关基因aflash1，本专利技术还公开了一种通过该无毒菌株防治黄曲霉污染的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黄曲霉无毒株（⊿Aflash1菌株）及其防治黄曲霉污染的应用。一种黄曲霉无毒株，所述的无毒株中aflash1基因基本上不表达。所述的无毒株：(1)aflash1基因片段缺失；(2)相对于野生型黄曲霉，所述的无毒株产生的孢子数量在培养基上显著上升；(3)相对于野生型黄曲霉，所述的无毒株产生的孢子数量在玉米粒等有机体上显著下降；(4)相对于野生型黄曲霉，所述的无毒株不产菌核。(5)相对于野生型黄曲霉，所述的无毒株未检测到黄曲霉毒素；所述的黄曲霉毒素包括：黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1），黄曲霉毒素B2（AflatoxinB2，AFB2），黄曲霉毒素G1（AflatoxinG1，AFG1），黄曲霉毒素G2（AflatoxinG2，AFG2）。(6)相对于野生型黄曲霉，所述的无毒株中产毒相关基因的表达下降；所述的产毒相关基因包括：aflR基因、aflS基因、aflC基因、aflD基因、aflK基因，和aflQ基因。(8)相对于野生型黄曲霉，所述的无毒株侵染宿主的能力下降；(9)所述的宿主包括：粮食及其制品、豆类及其制品、坚果及其制品、植物油及其制品、调味香辛料及其制品和饲料；(10)所述的侵染宿主的能力包括：在宿主上定殖生成菌丝、产生孢子、产菌核，以及产生黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1，和AFG2。所述的无毒株通过同源重组的方法从黄曲霉菌株PTS(来源于AspergillusflavusCA14菌株，引自AspergillusflavusaswA,agenehomologofAspergillusnidulansoefC,regulatessclerotialdevelopmentandbiosynthesisofsclerotium-associatedsecondarymetabolites）的染色体中敲除aflash1基因获得，所述的aflash1基因具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述的Aflash1蛋白具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。在本专利技术的第二方面，提供一种基于⊿Aflash1无毒株防治黄曲霉污染的方法，所述方法包括：(1)利用该菌株不产黄曲霉毒素（图2），在人工培养基中高产孢的特点，其产孢量是野生型菌株的3倍以上（图3），在培养基上人工培养大量的该黄曲霉菌株的孢子；(2)将步骤(1)中获得的孢子释放到受野生黄曲霉污染的区域（包括上述的花生产区）。(3)利用⊿Aflash1株的无毒（图3），不产菌核（图4），在有机体上低产孢，低致病力的特性（图5和图6），通过步骤（2）大量该菌株的分生孢子与野生产毒黄曲霉菌株在花生主产区等黄曲霉易感区域争夺有限的生态位，有效降低野生产毒黄曲霉菌株的密度，从而有效控制和降低作物受到的黄曲霉感染，黄曲霉毒素污染及其引发的曲霉病感染。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。本专利技术的优点在于：目前对黄曲霉污染的研究主要集中在黄曲霉毒素致病机理研究，产毒机理研究，以及黄曲霉毒素污染检测方法的改进等方面，对如何控制黄曲霉对作物的污染方面的研究甚少。本专利技术能有效控制和降低作物受到的产毒黄曲霉感染，有利于在作物生长和存储时从根本上解除黄曲霉毒素的产生，积累，从而有效控制黄曲霉毒素的污染。我国的广大亚热带地区常年温暖湿润，农作物受黄曲霉及黄曲霉毒素广泛污染，严重危及了食品安全，和广大人民群众的健康，和社会经济的健康发展。而且AFs中的AFB1具有强肝脏毒性和致癌效应，是现在发现的毒性和致癌性最强的天然污染物。由于AFs热学性质稳定,要加热到268℃-269℃才会分解,因此对己经霉变的上述食品，即使加热煮熟也无法消除其中的黄曲霉毒素。而本专利技术与其他黄曲霉毒素污染检测，以及毒素污染后解毒等技术相比，从源头上控制黄曲霉的污染，成本显著降低，为抑制和减少黄曲霉菌在粮食等农作物生产和存储过程中产生黄曲霉毒素，为避免其对人畜健康和社会经济造成重大危害提供一条可行的途径。因此，本研究具有潜在的巨大的经济和社会效益。附图说明图1.⊿Aflash1黄曲霉菌株构建。A．⊿Aflash1黄曲霉菌株构建模式图的产毒情况；B.Q-PCR鉴定在野生型菌株（WT）,⊿Aflash1菌株，和aflash1基因回补菌株（com-ash1）中aflash1基因的表达情况。图2.TLC分析⊿Aflash1黄曲霉菌株的产毒情况。A．TLC分析结果；B.基于TLC结果柱状图显示⊿Aflash1黄曲霉菌株中最主要毒素AFB1的合成情况；C.Q-PCR分析黄曲霉毒素合成关键基因在各菌株中的表达情况。图3.⊿Aflash1菌株的产孢量显著增加。A．野生型，互补和⊿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株黄曲霉无毒株，其特征在于，所述的无毒株中不表达

【技术特征摘要】
1.一株黄曲霉无毒株，其特征在于，所述的无毒株中不表达aflash1基因。2.根据权利要求1所述的黄曲霉无毒株，其特征在于，其通过同源重组的方法从黄曲霉菌株PTS的染色体中敲除aflash1基因获得。3.根据权利要求1所述的黄曲霉无毒株，其特征在于，所述的aflash1基因其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.一种如权利要求1所述的菌株在防治黄曲霉污染中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括：(...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄振宏，汪世华，高媛媛，李宇，袁军，胡育乐，刘亚举，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35