本发明专利技术提供了一种CDKN2B基因变异率的定量检测方法，具体的，本发明专利技术通过采用通过在一个反应体系内完成CDKN2B表达水平和突变率两个指标的检测，来定量检测CDKN2B的变异率，与现有技术中常规定量PCR技术必须分为两步或更多步骤，才能获得该基因的变异率相比，本发明专利技术的技术方案，操作更简便，节省时间，花费更低，数据更加具有可比性。
Kit for detecting CDKN2B gene variation and quantitative detection method for CDKN2B gene mutation rate
The invention provides a CDKN2B gene mutation rate quantitative detection method, specifically, the invention completes the CDKN2B expression level and mutation rate of two indicators in a reaction system by using, for quantitative detection of CDKN2B mutation rate, the amount of PCR must be divided into two steps or more steps and often prescribed in the prior art, in order to obtain the variation rate of the gene compared to the technical scheme of the invention, more convenient operation, time saving, lower cost and more comparable data.
【技术实现步骤摘要】
用于检测CDKN2B基因变异的试剂盒及CDKN2B基因变异率的定量检测方法
本专利技术涉及基因变异率检测方法领域，更具体的，本专利技术涉及一种用于检测CDKN2B基因变异的试剂盒及CDKN2B基因变异率的定量检测方法。
技术介绍
CDKN2B(Cyclin-dependentkinase4inhibitorB)是细胞周期激酶抑制因子，毗邻肿瘤抑制基因CDKN2A，是一个频发突变的区域，这些变异可以在很多肿瘤病例检测到。该基因编码细胞周期激酶抑制因子，与CDK4或CDK6形成复合物，抑制细胞周期激酶的活性，通过控制细胞周期G1的进程，功能蛋白是一种细胞生长调节作用。该基因的表达受到TGFbeta诱导，提示参与TGFbeta的生长调控。目前，CDKN2B基因的检测主要用于临床糖尿病人预测，并且由于很多基于CDK的抗肿瘤药物已经开始临床试验，该基因可以监测药物治疗中的疗效和预后，具有很高的临床应用价值，因此，CDKN2B的突变率检测是目前的研究热点之一。现有技术中，采用常规定量PCR技术检测CDKN2B的突变率，必须分为两步或更多步骤，才能获得该基因的变异率，使用不方便，花费也高，限制了应用。本文专利技术的新方法，可以在一个反应体系内完成CDKN2B表达水平和突变率两个指标的检测，与现有方法比较，数据更加具有可比性，同时，节省时间和花费。
技术实现思路
本专利技术提供了一种高效、简便且特异性和灵敏度高的CDKN2B基因变异率的定量检测方法。本专利技术第一方面，提供了一种用于检测CDKN2B基因变异的试剂盒，所述试剂盒用于CDKN2B基因变异率的定量检测；其中，所述试剂盒包含一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针。优选的，所述试剂盒中，一对靶基因特异性引物为突变区引物和保守区引物，所述两条不同荧光标记的探针分别为FAM标记的非突变探针，和vic标记的突变探针；更进一步的优选，所述①突变区引物和vic标记的突变探针的核苷酸序列分别为：正向引物(ForwardPrimer)：CTTATGCAGTTCCTCACCAAAGTTT；逆向引物(ReversePrimer)：GGATAGGAAGAGAACCGCAAGTT；vic标记的突变探针(Probe)：VIC-AGGCAACAAATCCA-NONE；所述②保守区引物和FAM标记的非突变探针为如下产品：AssayIDHs03922281_s1，Catalog#4426961，ABIPRODUCTUSA。本专利技术另一方面提供了一种CDKN2B基因变异率的定量检测检测方法，包括以下步骤：(1)提取CDKN2B基因组DNA作为模板；(2)向反应体系中加入PCR预混合液，权利要求1～3任一项所述的一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针和DNA模板进行定量PCR；(3)检测步骤(3)突变区和非突变区的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数(CT值)；(4)根据步骤(4)突变区和非突变区CT值计算变异系数，即变异系数(％)＝突变CT值/非突变CT值x100。上述方法中，优选，步骤(1)DNA的提取采用DNeasyBlood&TissueKit(Qiagen产品)，按照说明书指引提取血液或组织DNA，鉴定DNA浓度和质量，-20℃存储备用；进一步的，优选，步骤(2)反应条件为：i)、50℃，2分钟；ii)、95℃，10分钟；iii)、95℃，15秒；iv)、59℃，1分钟；其中iii)和iv)进行45个循环；并且所述的PCR预混合液为2xMastermix。在本专利技术的另一个更优选的实施方式中，提供了一种CDKN2B基因变异率的定量检测检测方法，包括以下步骤：(1)提取CDKN2B基因组DNA：用DNeasyBlood&TissueKit(Qiagen产品)，按照说明书指引提取血液或组织DNA；(2)定量PCR：反应体系：PCR预混合液选用2xMastermix(UniversalPCRMasterMix,ABI):20ul引物(Primer)-MF(50nM):0.5ul引物(Primer)-MR(50nM):0.5ul探针(Probe)-MP(250nM):0.5ulHs03922281_s1:1.0ul模板DNA(10-20ng/ml):10ul去离子水:7.5ul总反应体积＝40ul反应条件：i)、50℃，2分钟；ii)、95℃，10分钟；iii)、95℃，15秒；iv)、59℃，1分钟；其中iii)和iv)进行45个循环。(3)检测结果：变异系数(％)＝突变CT值/非突变CT值x100。本专利技术所提供的的CDKN2B基因变异率的定量检测方法的检测结果判定方法如下：反应是由一套标记了不同荧光的探针和引物组成，在检索方案中，先由一对引物加不易发生变异区的荧光标记探针(例如，优选FAM标记的非突变探针，更优选为试验码(AssayID)：Hs03922281_s1，登记号(Catalog#)：4426961，ABI产品(ABIPRODUCTUSA))检测总CDKN2B表达水平，同时，另外一个不同荧光标记探针(例如优选vic标记的突变探针)位于变异区，如果发生变异，变异区探针不能结合扩增产物，计数降低，最后，通过变异区与稳定区计数差异和比值，计算出该基因的变异率。变异率(％)＝(稳定区总基因计数-变异区基因计数)x100/稳定区总基因计数。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术提供的试剂盒检测灵敏度高；本专利技术所提供的CDKN2B基因变异率的定量检测方法可以在一个反应体系内完成CDKN2B表达水平和突变率两个指标的检测，与现行方法比较，数据更加具有可比性，检测结果准确率更高，同时，节省时间和花费。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步，应当理解，以下实施例仅用于说明本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1CDKN2B基因变异率的定量检测方法(1)提取CDKN2B基因组DNA：用DNeasyBlood&TissueKit(Qiagen产品)，按照说明书指引提取血液或组织DNA；(2)定量PCR：反应体系：PCR预混合液选用2xMastermix(UniversalPCRMasterMix,ABI):20ul引物(Primer)-MF(50nM):0.5ul引物(Primer)-MR(50nM):0.5ul探针(Probe)-MP(250nM):0.5ulHs03922281_s1:1.0ul模板DNA(10-20ng/ml):10ul去离子水:7.5ul总反应体积＝40ul反应条件为：i)、50℃，2分钟；ii)、95℃，10分钟；iii)、95℃，15秒；iv)、59℃，1分钟；其中iii)和iv)进行45个循环。(3)检测结果：变异系数(％)＝突变CT值/非突变CT值x100。当变异系数大于正常人对照3倍以上者为异常。上述诊断结果可以用于具有消化道，泌尿系统恶性肿瘤的辅助性诊断。以上所述实施例仅表达了本专利技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利技术专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测CDKN2B基因变异的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于CDKN2B基因变异率的定量检测；其中，所述试剂盒包含一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测CDKN2B基因变异的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于CDKN2B基因变异率的定量检测；其中，所述试剂盒包含一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述一对靶基因特异性引物为突变区引物和保守区引物，所述两条不同荧光标记的探针分别为FAM标记的非突变探针，和vic标记的突变探针。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，①突变区引物和vic标记的突变探针的核苷酸序列分别为：正向引物(ForwardPrimer)：CTTATGCAGTTCCTCACCAAAGTTT；逆向引物(ReversePrimer)：GGATAGGAAGAGAACCGCAAGTT；vic标记的突变探针(Probe)：VIC-AGGCAACAAATCCA-NONE；②保守区引物和FAM标记的非突变探针为如下产品：试验代码(AssayID)为Hs03922281_s1，登记号(Catalog#)：4426961，ABI产品(ABIPRODUCTUSA)。4.一种CDKN2B基因变异率的定量检测检测方法，包括以下步骤：(1)提取CDKN2B基因组DNA作为模板；(2)向反应体系中加入PCR预混合液：权利要求1～3任一项所述的一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针和DNA模板进行定量PCR；(3)检测步骤(2)突变区和非突变区的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数(CT值)；(4)根据步骤(3)突变区和非突变区CT值计算变异系数，即变异系数(％)＝突...
【专利技术属性】
技术研发人员：张海鹰，严杰，董文明，金嘉敏，
申请(专利权)人：苏州西山中科实验动物有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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