本发明专利技术公开了新的赖氨酸脱羧酶，其氨基酸序列由SEQ ID NO:1所示序列突变而来，在选自下组的一个或多个氨基酸残基位点发生突变：9位、44位、88位、111位、176位和230位。本发明专利技术的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸产生1,5‑戊二胺的活性显著提高，从而可以降低催化剂的用量最终降低生产成本。本发明专利技术还提供了包含所述赖氨酸脱羧酶的编码序列的表达载体、包含能够表达所述赖氨酸脱羧酶的宿主细胞以及它们在产生1,5‑戊二胺中的用途和生产方法。
【技术实现步骤摘要】
新的赖氨酸脱羧酶突变体及其应用
本专利技术涉及生物
具体地说，本专利技术涉及具有高活性的赖氨酸脱羧酶、包含该赖氨酸脱羧酶编码基因的表达载体和能够表达该赖氨酸脱羧酶的基因工程菌，以及所述赖氨酸脱羧酶、表达载体和基因工程菌在生产1,5-戊二胺中的应用。
技术介绍
1,5-戊二胺，又名尸胺、1,5-二氨基戊烷、五亚甲基二胺和尸毒素，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，是赖氨酸在赖氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.18)的作用下脱羧产生的，反应为L-lysine+H+→CO2+cadaverine。1,5-戊二胺具有各种各样的功能及用途。例如，在农业上，1,5-戊二胺可用于调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育、改善植物果实发育、提高果实产量。在医学上，它可作为一种有效治疗痢疾的药物，也是一种重要的药物中间体。在工业上，1,5-戊二胺是一种重要的化工原料；将1,5-戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料-新型尼龙，1,5-戊二胺基不依赖于石油原料的生物制造工艺可能对尼龙工业产生颠覆性的影响。尼龙66是由己二胺和己二酸1:1聚合生成，与尼龙6同为尼龙两大品种之一。目前，己二胺或其合成前体己二腈国内主要依赖进口。1,5-戊二胺与己二胺互为同系物，在结构上与己二胺非常相似，可以替代己二胺，和二元酸共聚合成具有实用性的尼龙5X(4、6、10等)。尼龙56性能媲美经典的尼龙66，而吸湿排干率、透气性、柔软度等性能更佳，可广泛应用作纤维(服装、轮胎、地毯等)和工程塑料(电子产品、汽车部件等)。尼龙54和尼龙510等其它以1,5-戊二胺为单体制成的尼龙产品具有特殊的材料性能，具有潜在的应用价值。赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧形成1,5-戊二胺，是1,5-戊二胺合成途径中的关键酶。赖氨酸脱羧酶存在于各种微生物中。目前，已经分别从大肠杆菌(E.coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)、反刍动物月形单胞菌(Selenomonasruminantium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)等细菌中克隆出赖氨酸脱羧酶基因。最新的研究普遍采用过表达大肠杆菌的CadA来生产1,5-戊二胺。日本味之素公司的US7189543专利中保护了以二羧酸调节pH并通过细胞过表达大肠杆菌的野生型CadA酶转化赖氨酸产生1,5-戊二胺，产量达69g/L。上海凯赛在其专利CN102851307A中通过在蜂房哈夫尼菌中过量表达大肠杆菌野生型CadA酶来转化赖氨酸，从而实现戊二胺和下游聚合物的制备。日本味之素公司的EP3118312专利中公开了热稳定性提高的大肠杆菌CadA突变位点Val3、Ala590和Glu690。日本三井化学公司的US2015132808专利保护了多个活性增加的大肠杆菌CadA突变体，然而，这些CadA突变体的活性提高程度均低于20％，甚至大多数CadA突变体的活性提高程度不到10％，因此这些CadA突变体在实际生产上的应用价值非常有限。赖氨酸脱羧酶作为催化赖氨酸生产1,5-戊二胺的催化剂，提升赖氨酸脱羧酶的活性可以减少催化剂的用量或缩短反应时间，进而降低生产成本，对1,5-戊二胺的工业化有重要的影响，因此本领域急需提升赖氨酸脱羧酶的性能，实现1,5-戊二胺的工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种性能提升的赖氨酸脱羧酶，以便实现1,5-戊二胺的工业化生产。在第一方面，本专利技术提供一种赖氨酸脱羧酶，所述赖氨酸脱羧酶是：(a)其氨基酸序列由SEQIDNO:1所示序列突变而来，在选自下组的一个或多个氨基酸残基位点发生突变：9位、44位、88位、111位、176位和230位；其中，9位、111位、176位和230位突变可以选自其他19种氨基酸，44位的氨基酸残基突变是Arg，88位的氨基酸残基突变是Ser；或(b)所述赖氨酸脱羧酶与(a)所述的氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列相同性，并且具有(a)所述蛋白的功能，其中对应于SEQIDNO:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位和/或230位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同；或(c)所述赖氨酸脱羧酶由在(a)所述的氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成，并且具有(a)所述赖氨酸脱羧酶的功能，其中对应于SEQIDNO:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位和/或230位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同。在具体的实施方式中，所述赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点突变为以下所示的氨基酸残基：9位：Arg、Lys、Gln、Asn；44位：Arg；88位：Ser；111位：Gly、Pro、Ala；176位：Val、Ile、Leu、Met、Phe、Ala；230位：His、Asn、Gln、Lys、Arg在具体的实施方式中，所述赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点具有以下所示的氨基酸残基：9位：Arg；44位：Arg；88位：Ser；111位：Gly；176位：Val；230位：His。在具体的实施方式中，所述赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列在9位为Arg，或者在44位为Arg，或者在88位为Ser，或者在111位为Gly，或者在176为Val，或者在230位为His。在第二方面，本专利技术提供一种表达载体，所述表达载体包含本专利技术第一方面所述的赖氨酸脱羧酶的编码序列。在第三方面，本专利技术提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本专利技术第二方面所述的表达载体或者其基因组中整合有本专利技术第一方面所述的赖氨酸脱羧酶的编码序列。在优选的实施方式中，所述宿主细胞是细菌；更优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；最优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在第四方面，本专利技术提供一种生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括：(1)利用本专利技术第一方面所述的赖氨酸脱羧酶或者本专利技术的三方面所述的宿主细胞生产1,5-戊二胺；和(2)从(1)的体系中分离得到1,5-戊二胺。在第五方面，本专利技术提供一种生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括：利用以下赖氨酸脱羧酶生产1,5-戊二胺，所述赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列与SEQIDNO:1所示氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列相同性，并且具有SEQIDNO:1所述蛋白的赖氨酸脱羧酶功能，而且在对应于SEQIDNO:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位和/或230位氨基残基发生一个或多个氨基酸残基突变；其中，利用所述赖氨酸脱羧酶生产1,5-戊二胺的产量是利用氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的赖氨酸脱羧酶的1.7倍以上。在第六方面，本专利技术提供本专利技术第一方面所述的赖氨酸脱羧酶或者本专利技术第二方面所述的表达载体或者本专利技术第三方面所述的宿主细胞在生产1,5-戊二胺中的应用。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种赖氨酸脱羧酶，所述赖氨酸脱羧酶是：(a)其氨基酸序列由SEQ ID NO:1所示序列突变而来，在选自下组的一个或多个氨基酸残基位点发生突变：9位、44位、88位、111位、176位和230位；其中，9位、111位、176位和230位突变可以选自其他19种氨基酸，44位的氨基酸残基突变是Arg，88位的氨基酸残基突变是Ser；或(b)所述赖氨酸脱羧酶与(a)所述的氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列相同性，并且具有(a)所述蛋白的功能，其中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位和/或230位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同；或(c)所述赖氨酸脱羧酶由在(a)所述的氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1‑30个，更优选1‑10个，还要优选1‑6个，最优选1‑3个氨基酸残基而形成，并且具有(a)所述赖氨酸脱羧酶的功能，其中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位和/或230位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同。
【技术特征摘要】
1.一种赖氨酸脱羧酶，所述赖氨酸脱羧酶是：(a)其氨基酸序列由SEQIDNO:1所示序列突变而来，在选自下组的一个或多个氨基酸残基位点发生突变：9位、44位、88位、111位、176位和230位；其中，9位、111位、176位和230位突变可以选自其他19种氨基酸，44位的氨基酸残基突变是Arg，88位的氨基酸残基突变是Ser；或(b)所述赖氨酸脱羧酶与(a)所述的氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列相同性，并且具有(a)所述蛋白的功能，其中对应于SEQIDNO:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位和/或230位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同；或(c)所述赖氨酸脱羧酶由在(a)所述的氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成，并且具有(a)所述赖氨酸脱羧酶的功能，其中对应于SEQIDNO:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位和/或230位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同。2.如权利要求1所述的赖氨酸脱羧酶，其特征在于，所述赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点突变为以下所示的氨基酸残基：9位：Arg、Lys、Gln、Asn；44位：Arg；88位：Ser；111位：Gly、Pro、Ala；176位：Val、Ile、Leu、Met、Phe、Ala；230位：His、Asn、Gln、Lys、Arg。3.如权利要求2所述的赖氨酸脱羧酶，其特征在于，所述赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点具...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙际宾，赵晶，刘娇，孙村民，郑平，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12
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