一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术提供了一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用，本发明专利技术具体是在大肠杆菌来源的植酸酶GHPH‑1的基础上通过大量突变和筛选获得的植酸酶突变体GHPH‑C以及GHPH‑C1、GHPH‑C2、GHPH‑C3、GHPH‑C4、GHPH‑C5、GHPH‑C6、GHPH‑C7；相比于未突变的植酸酶，本发明专利技术得到的植酸酶突变体的耐热性得到显著提高，适应的pH范围也更广泛，有利于其在饲料领域的开发和应用。

【技术实现步骤摘要】
一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用。
技术介绍
植物性饲料中含有大量的植酸磷，但这些植酸磷不能被单胃畜禽动物有效地利用，造成了无机磷的浪费，同时未被利用的磷源通过粪便排泄到环境中，导致了环境污染。此外，植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物胃肠道中会与多种金属离子如钙、镁、锌、铁等以及蛋白质鳌合形成不溶性复合物，降低了动物对这些营养物质的有效利用。植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸盐的一类酶的总称，它可以催化肌醇六磷酸(盐或醋)脱掉磷酸基团，从而分解动物饲料中的天然有机磷。在饲料中添加植酸酶可以代替部分磷酸氢钙，同时降低动物粪便中的磷，减少了集约化畜牧场排除粪便中磷对环境的污染。目前，市场中的植酸酶多数有比较好的活性，但是很多耐热性能一般。通常饲料生产中，酶制剂与饲料混匀后在80℃左右的高温造粒，在此过程中酶易变性失活，解决这一问题的一种方法是利用包被剂和载体来提高酶的耐热性，但这无疑会增加酶制剂的生产成本，而且采用包被处理酶制剂会严重影响其生物利用率；另一种经济有效的方法就是通过改良酶的基因提高其耐热性。从酶的基因和结构入手，筛选得到耐热型植酸酶对降低目前饲用植酸酶的生产成本，提高其利用效率具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供了一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用，本专利技术通过人工基因突变和大量筛选的方法，对大肠杆菌来源的植酸酶GHPH-1（氨基酸序列SEQIDNO：2，编码的核苷酸序列SEQIDNO：1）进行改良，优选地，首先在GHPH-1的第63位点进行定点饱和突变，筛选得到热稳定性提高的突变体GHPH-C，继续以GHPH-C为模板用易错PCR的方法对该基因进行二轮随机突变，经过大批量筛选，得到热稳定性进一步提高的突变体GHPH-C1、GHPH-C2、GHPH-C3、GHPH-C4、GHPH-C5、GHPH-C6和GHPH-C7。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了耐热型单位点植酸酶突变体GHPH-C，所述的植酸酶突变体GHPH-C的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示，所述突变体GHPH-C由氨基酸序列为SEQIDNO：2的植酸酶的第63位氨基酸由Arg变为Cys获得。本专利技术提供了耐热型双位点植酸酶突变体，所述双位点植酸酶突变体包括：氨基酸序列如SEQIDNO：4所示的GHPH-C1、氨基酸序列如SEQIDNO：5所示的GHPH-C2、氨基酸序列如SEQIDNO：6所示的GHPH-C3和氨基酸序列如SEQIDNO：7所示的GHPH-C4。本专利技术提供了耐热型三位点植酸酶突变体，所述三位点植酸酶突变体包括氨基酸序列如SEQIDNO：8所示的GHPH-C5和氨基酸序列如SEQIDNO：9所示的GHPH-C6。本专利技术提供了耐热型五位点植酸酶突变体GHPH-C7，其具有如SEQIDNO：10所示的氨基酸序列。本专利技术提供了分别产生所述的植酸酶突变体的编码基因。本专利技术提供了含有所述的植酸酶突变体的编码基因的重组菌株。所述重组菌株为毕赤酵母GS115。本专利技术提供了所述的植酸酶突变体在用于制备水产类养殖饲料中的应用。本专利技术提供了所述的植酸酶突变体在用于制备畜禽类养殖饲料中的应用，所述畜禽类包括猪、肉鸡、蛋鸡和鸭。进一步的：所述植酸酶突变体用于饲料中时以液体酶制剂或固体酶制剂形式混匀在饲料中使用，其使用量为每克饲料中包含1~10U植酸酶。与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术基于SEQIDNO：1的植酸酶GHPH-1，所述植酸酶突变体首先在第63位的氨基酸有改变，置换方式为R63C；其次可能在第10位、第29位、第138位、第172位、第207位、第243位、第287位、第297位、第307位和第397位中一个或多个位置的氨基酸有改变，相应的置换方式为：S10N、M29F、A138L、F172W、L207E、W243P、Q287S、V297M、L307P、G311K和T397E。本专利技术以植酸酶GHPH-1为基础，提供了包含R63C的单点突变体GHPH-C，包含R63C/S10N的双位点突变体GHPH-C1、包含R63C/F172W的双位点突变体GHPH-C2、包含R63C/L207E的双位点突变体GHPH-C3、包含R63C/Q287S的双位点突变体GHPH-C4；包含R63C/A138L/V297M的三位点突变体GHPH-C5、包含R63C/F172W/G311K的三位点突变体GHPH-C6；以及包含R63C/M29F/A138L/W243P/L307P的五位点突变体GHPH-C7。本专利技术根据所取代的位置和氨基酸，与原始植酸酶GHPH-1相比，改造后的突变体GHPH-C以及GHPH-C1、GHPH-C2、GHPH-C3、GHPH-C4、GHPH-C5、GHPH-C6、GHPH-C7在80℃处理3分钟时的热稳定性是原来的1.9~3.3倍；同时得到的植酸酶突变体GHPH-C6适应的pH范围更广泛，在pH3~4的酸性环境中其相对酶活较未突变的GHPH-1约提高了35%~60%，而GHPH-C2和GHPH-C6抵抗蛋白酶的降解能力有所提高，约为未突变的2倍。通过本专利技术技术方案得到的植酸酶可以有利于植酸酶在饲料中的广泛应用。附图说明图1表明本专利技术所述植酸酶突变体的热稳定性；图2是本专利技术所述植酸酶突变体GHPH-C6温度曲线；图3表明本专利技术所述植酸酶突变体对胃蛋白酶的耐受性。具体实施方式为了便于理解本专利技术，以下将结合较佳的实施例对本文专利技术做更全面、细致地描述，但本专利技术的保护范围并不限于以下具体实施例。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行,或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。1.菌株和载体毕赤酵母GS115，质粒pPIC9K，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌OrigamiB，大肠杆菌BL21，质粒pET21a(+)购自Invitrogen公司。2．试剂与培养基质粒提取试剂盒，片段纯化回收试剂盒，限制性内切酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；GeneMorphII随机突变PCR试剂盒购自Stratagene公司；氨苄青霉素，IPTG等购自生工生物工程(上海)股份有限公司。LB培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl；MD培养基：1.34%YNB，0.4mg/L生物素，2%葡萄糖；YPD培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液（pH6.0），1.34%YNB，0.4mg/L生物素，1%甘油；BMMY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液（pH6.0），1.34%YNB，0.4mg/L生物素，1%甲醇；BSM培养基：26.7mL85%的磷酸，0.93g二水硫酸钙，14.9g二水硫酸镁，4.13g氢氧化钾，18.2g硫酸钾，40g甘油，4.0mlLPMT1。以上培养基为固体时加入2%的琼脂粉。3．实验方法菌株培养条件：大肠杆菌3本文档来自技高网...

【技术保护点】
耐热型单位点植酸酶突变体GHPH‑C，其特征在于：所述的植酸酶突变体GHPH‑C的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述突变体GHPH‑C由氨基酸序列为SEQ ID NO：2的植酸酶的第63位氨基酸由Arg变为Cys获得。

【技术特征摘要】
1.耐热型单位点植酸酶突变体GHPH-C，其特征在于：所述的植酸酶突变体GHPH-C的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示，所述突变体GHPH-C由氨基酸序列为SEQIDNO：2的植酸酶的第63位氨基酸由Arg变为Cys获得。2.耐热型双位点植酸酶突变体，其特征在于：所述双位点植酸酶突变体包括：氨基酸序列如SEQIDNO：4所示的GHPH-C1、氨基酸序列如SEQIDNO：5所示的GHPH-C2、氨基酸序列如SEQIDNO：6所示的GHPH-C3和氨基酸序列如SEQIDNO：7所示的GHPH-C4。3.耐热型三位点植酸酶突变体，其特征在于：所述三位点植酸酶突变体包括氨基酸序列如SEQIDNO：8所示的GHPH-C5和氨基酸序列如SEQIDNO：9所示的GHPH-C6。4.耐热型五位点植酸酶突变体...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖志壮，崔巍，薛海曌，方安然，张稳，
申请(专利权)人：青岛红樱桃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37