一种胰岛素抵抗状态下子宫内膜增殖培育方法技术

本发明专利技术涉及一种胰岛素抵抗状态下子宫内膜增殖培育方法，所述方法包括：步骤1，胰岛素抵抗动物模型的建立；步骤2，将所述大鼠去势及给予雌激素；步骤3，阴道脱落细胞巴氏染色；步骤4，分离肝脏、内脏脂肪和子宫；步骤5，组织学染色。因此，本发明专利技术的子宫内膜增殖培养方法实现了有效和快速的实现子宫内膜增殖培养。

Method for culturing endometrial hyperplasia under insulin resistance

The invention relates to a method for cultivating insulin resistance endometrial proliferation status, the method includes: Step 1, insulin resistance animal model; step 2, the rats of castration and estrogen administration; step 3, vaginal exfoliated cells Papanicolaou staining; step 4, liver, uterus and visceral fat separation steps; 5 histological staining. Therefore, the endometrial proliferation culture method of the invention realizes effective and fast endometrial proliferation culture.

【技术实现步骤摘要】
一种胰岛素抵抗状态下子宫内膜增殖培育方法
本专利技术涉及一种培养方法，尤其涉及一种胰岛素抵抗状态下子宫内膜增殖培育方法。
技术介绍
子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率呈逐年上升且年轻化的趋势。大量流行病学研究表明肥胖、糖尿病和胰岛素抵抗是子宫内膜癌的危险因素。近年来，随着生活水平的提高及生活方式的改变、膳食结构的变化，超重和肥胖人群逐年增多。大量脂肪摄入是胰岛素抵抗形成的主要因素，胰岛素作为生长因子家族的成员调控细胞生长和能量代谢，在肿瘤形成过程中起重要作用，子宫内膜增殖是子宫内膜癌的癌前病变，饮食引起的代谢异常与子宫内膜增殖和子宫内膜癌的关系仍不明确。因此在验证利用长期高脂饮食诱导的胰岛素抵抗对子宫内膜增殖影响时需要建立一种动物模型，并为进一步深入的胰岛素抵抗和高胰岛素血症与子宫内膜增殖和子宫内膜癌发生之间的相互作用机制研究奠定实验室基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种建立胰岛素抵抗和子宫内膜增殖动物模型方法，可以有效和快速的实现子宫内膜增殖。为实现上述目的，本专利技术提供了一种胰岛素抵抗状态下子宫内膜增殖培育方法，所述方法包括：步骤1，胰岛素抵抗动物模型的建立；1.1，将大鼠适应性喂养1周后分为2组，对照组(N组)、雌激素组(NE组)和胰岛素抵抗+雌激素组组(FE组)；1.2，给予对照组和雌激素组正常维持饲料饮食：碳水化合物66％、脂肪10％、蛋白质24％，胰岛素抵抗+雌激素组高脂饮食：碳水化合物20％、脂肪60％、蛋白质20％；1.3，大鼠喂养40周，禁食10～12h，内眦静脉取血检测血脂、空腹血糖及胰岛素水平，计算HOMA-IR指数，腹腔注射葡萄糖后于30min、60min、90min和120min尾静脉取血测定血糖值并计算血糖曲线下面积；1.4，测定糖耐量1周，两组大鼠禁食5～7h，尾静脉取血测空腹血糖后，腹腔注射胰岛素，测定30min、60min、90min和120min血糖值并计算曲线下面积；步骤2，将所述大鼠去势及给予雌激素；2.1，大鼠取仰卧位，消毒后5％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉，于尿道口上方1cm处向上行正中纵形切口皮肤3cm，分离皮下组织及肌肉进入腹腔，在子宫角与输卵管交界靠子宫角侧结扎，摘除大鼠双侧卵巢，关闭腹腔。对照组仅切开皮肤暴露腹腔取出与卵巢等量的脂肪组织后关闭腹腔；2.2，术后1周，灌胃给予雌激素和胰岛素抵抗+雌激素组大鼠17β-雌二醇【800μg/kg(体重)】4周，对照组给予等量溶剂橄榄油；步骤3，阴道脱落细胞巴氏染色；3.1，给予溶剂或17β-雌二醇3天后，每天行阴道涂片的巴氏染色：95％酒精5min，碳酸锂溶液5min，95％酒精5min，橘黄染液3min，95％酒精Ⅰ、Ⅱ各5min，EA-505min，95％酒精Ⅰ、Ⅱ各5min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min，中性树胶封片；步骤4，分离肝脏、内脏脂肪和子宫；4.1，给予雌激素4周后，暴露腹腔处理，分离腹腔脂肪并称重，分离子宫并称量子宫的湿重和干重，取子宫角中段8-10mm和5mm×5mm×5mm肝脏固定于10％中性福尔马林中用于HE染色，观察肝脏脂肪样变和子宫上皮鳞状化生，测量子宫腔上皮细胞和腺上皮细胞高度、固有层和肌层的厚度。剩余组织经液氮迅速冷冻后置于-80℃冰箱保存，断颈处死大鼠；步骤5，组织学染色；5.1，固定于10％中性福尔马林中的肝脏和子宫组织经石蜡包埋、切片，烤片2h后，脱蜡入水，苏木精染色后盐酸酒精分化至切片呈粉红色，氨水返蓝后，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明处理，中性树胶封片；进一步的，所述方法还包括：步骤6，统计学处理；6.1，定量资料以均值±标准差表示，两组比较采用独立样本的t检验，三组比较采用单因素方差分析。因此，本专利技术的一种胰岛素抵抗状态下子宫内膜增殖培育方法方法实现了有效和快速的实现子宫内膜增殖培养。附图说明图1为本专利技术一种胰岛素抵抗状态下子宫内膜增殖培育方法的流程图。具体实施方式下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。长期高脂饮食诱导的胰岛素抵抗是否影响子宫内膜增殖，代谢异常与子宫内膜增殖及其癌变之间的关系目前尚不明确。本专利技术通过对正常Sprague-Dawley大鼠进行长期的高脂饮食，诱导大鼠胰岛素抵抗，观察在胰岛素抵抗状态下，大鼠子宫内膜增殖的变化，为进一步专利技术高胰岛素环境及糖代谢异常对子宫内膜的作用机制提供实验依据。图1为本专利技术子宫内膜增殖培养方法的流程图，如图所示，本专利技术具体包括如下步骤：材料的准备。材料是SPF级性成熟雌性性成熟Sprague-Dawley大鼠(8周龄)27只，购自北京维通利华公司。大鼠体重无明显差异，自由进食水、光照12h/天，饲养环境为室温20～25℃、湿度40-50％。高脂饲料(60％脂肪含量)购自北京华阜康公司，葡萄糖、17β-雌二醇购自美国Sigma公司，血糖试纸和血糖仪购自美国罗氏公司。步骤1，胰岛素抵抗动物模型的建立；1.1，适应性喂养1周后，大鼠分为3组，即对照组(N组，n＝9)、雌激素组(NE组，n＝9)和胰岛素抵抗+雌激素组(FE组，n＝9)；1.2，给予对照组和雌激素组正常维持饲料饮食(碳水化合物66％，脂肪10％，蛋白质24％)、给予胰岛素抵抗+雌激素组高脂饮食(碳水化合物20％，脂肪60％，蛋白质20％)；1.3，大鼠喂养40周时，禁食10～12h后，内眦静脉取血检测血脂(酶法)、空腹血糖(氧化酶法)及胰岛素水平(碘125放射免疫法)，计算HOMA-IR指数【空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(mU/ml)/22.5)】，腹腔注射葡萄糖(2g/kg)后于30min、60min、90min和120min测定血糖值并计算血糖曲线下面积；1.4，测定糖耐量1周后，各组大鼠禁食7h后，尾静脉取血测空腹血糖水平后，腹腔注射胰岛素(0.75U/kg)，测定30min、60min、90min和120min血糖值并计算曲线下面积；步骤2，将所述大鼠去势及给予雌激素；2.1，大鼠取仰卧位，消毒后5％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉，于尿道口上方约1cm处向上行正中纵形切口皮肤约3cm，分离皮下组织及肌肉进入腹腔，在子宫角与输卵管交界靠子宫角侧结扎，摘除大鼠双侧卵巢，关闭腹腔。对照组仅切开皮肤暴露腹腔，取出卵巢旁等量脂肪组织后关闭腹腔。2.2，术后1周，灌胃给予雌激素组和胰岛素+雌激素组大鼠17β-雌二醇【800μg/kg(体重)】4周，对照组给予等量溶剂橄榄油。步骤3，阴道脱落细胞巴氏染色；3.1，给予溶剂或17β-雌二醇3天后，每天行阴道涂片后行脱落细胞的巴氏染色，95％酒精固定5min，碳酸锂溶液5min，95％酒精5min，橘黄染液3min，95％酒精Ⅰ、Ⅱ各5min，EA-505min，95％酒精Ⅰ、Ⅱ各5min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min，中性树胶封片。步骤4，分离肝脏、内脏脂肪和子宫；4.1，给予溶剂或17β-雌二醇(800μg/kg【体重】)4周后，暴露腹腔操作如前，分离腹腔脂肪并称重，分离子宫并称量子宫的湿重和干重。取子宫角中段8～10mm和5mm×5mm×5mm的肝脏固定于10％中性福尔马林中用于HE本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰岛素抵抗状态下子宫内膜增殖培育方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1，胰岛素抵抗动物模型的建立；1.1，将大鼠适应性喂养1周后，编号并随机、平均分为3组：对照组、雌激素组和胰岛素抵抗+雌激素组；1.2，给予对照组和雌激素组正常维持饲料饮食：碳水化合物66％、脂肪10％、蛋白质24％；给予胰岛素抵抗+雌激素组高脂饮食：碳水化合物20％、脂肪60％、蛋白质20％；1.3，喂养大鼠40周，禁食10～12h，内眦静脉取血检测血脂、空腹血糖及胰岛素水平，计算HOMA‑IR指数，腹腔注射葡萄糖后于30min、60min、90min和120min尾静脉取血测定血糖值并计算血糖曲线下面积；1.4，测定葡萄糖耐量1周后，大鼠禁食7h，尾静脉取血测空腹血糖，腹腔注射胰岛素，测定30min、60min、90min和120min血糖值并计算曲线下面积；步骤2，将所述大鼠去势及给予雌激素；2.1，大鼠取仰卧位，消毒腹部后用50mg/kg(体重)戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，于尿道口上方1cm处向上行正中纵形切口皮肤3cm，分离皮下组织及肌肉进入腹腔，在子宫角与输卵管交界靠子宫角侧结扎，摘除大鼠双侧卵巢后关闭腹腔，对照组仅切开皮肤暴露腹腔取出与卵巢等量的脂肪组织后关闭腹腔；2.2，术后1周，灌胃给予雌激素和胰岛素抵抗+雌激素组大鼠17β‑雌二醇4周，对照组给予等量溶剂橄榄油；步骤3，阴道脱落细胞巴氏染色；3.1，给予溶剂或17β‑雌二醇3天后，每天行阴道涂片后行如下步骤：95％酒精5min，碳酸锂溶液5min，95％酒精5min，橘黄染液3min，95％酒精Ⅰ、Ⅱ各5min，EA‑50 5min，95％酒精Ⅰ、Ⅱ各5min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min，中性树胶封片；步骤4，分离肝脏、内脏脂肪和子宫；4.1，给予溶剂或17β‑雌二醇4周，用50mg/kg(体重)戊巴比妥钠麻醉大鼠后再次暴露其腹腔，分离腹腔脂肪并称重，分离子宫并称量子宫的湿重和干重后，取子宫角中段8～10mm和5mm×5mm×5mm肝脏固定于10％中性福尔马林中用于HE染色，观察肝脏脂肪样变和子宫上皮鳞状化生，测量子宫腔上皮细胞和腺上皮细胞高度、固有层和肌层的厚度；4.5，剩余组织经液氮迅速冷冻后置于‑80℃冰箱保存，断颈处死大鼠。步骤5，组织学染色；5.1，固定于10％中性福尔马林中的肝脏和子宫组织经石蜡包埋、切片、烤片后脱蜡入水，苏木精染色后盐酸酒精分化至切片呈粉红色，氨水返蓝后，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明处理，中性树胶封片。...

【技术特征摘要】
1.一种胰岛素抵抗状态下子宫内膜增殖培育方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1，胰岛素抵抗动物模型的建立；1.1，将大鼠适应性喂养1周后，编号并随机、平均分为3组：对照组、雌激素组和胰岛素抵抗+雌激素组；1.2，给予对照组和雌激素组正常维持饲料饮食：碳水化合物66％、脂肪10％、蛋白质24％；给予胰岛素抵抗+雌激素组高脂饮食：碳水化合物20％、脂肪60％、蛋白质20％；1.3，喂养大鼠40周，禁食10～12h，内眦静脉取血检测血脂、空腹血糖及胰岛素水平，计算HOMA-IR指数，腹腔注射葡萄糖后于30min、60min、90min和120min尾静脉取血测定血糖值并计算血糖曲线下面积；1.4，测定葡萄糖耐量1周后，大鼠禁食7h，尾静脉取血测空腹血糖，腹腔注射胰岛素，测定30min、60min、90min和120min血糖值并计算曲线下面积；步骤2，将所述大鼠去势及给予雌激素；2.1，大鼠取仰卧位，消毒腹部后用50mg/kg(体重)戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，于尿道口上方1cm处向上行正中纵形切口皮肤3cm，分离皮下组织及肌肉进入腹腔，在子宫角与输卵管交界靠子宫角侧结扎，摘除大鼠双侧卵巢后关闭腹腔，对照组仅切开皮肤暴露腹腔取出与卵巢等量的脂肪组织后关闭腹腔；2.2，术后1周，灌胃给予雌激素和胰岛素抵抗+雌激素组大鼠17β-雌二醇4周，对照组给予等量溶剂橄榄油；步骤3，阴道脱落细胞巴氏染色；3.1，给予溶剂或17β-雌二醇3天后，每天行阴道涂片后行如下步...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩，尚晨光，刘林枝，冯宗昊，任雅丽，
申请(专利权)人：张岩，
类型：发明
国别省市：北京,11