一种水体中微生物DNA的提取方法技术

一种水体中微生物DNA的提取方法，采用无菌微孔滤膜收集微生物，利用物理和化学方法破碎微生物细胞，其次采用醋酸钾、异硫氰酸胍、柠檬酸钠等试剂去除腐殖酸等杂质，将细胞裂解液进行多次离心纯化，最后用乙醇和醋酸钾抽提后得到纯化的微生物基因组DNA，所提取的微生物DNA具有较好的完整性，纯度高，产量高，其OD260/OD280比值在1.8～2.0之间，经琼脂糖凝胶电泳后染色，DNA条带清晰且单一，无拖尾，无杂带，获得的微生物DNA产量高、操作简单、成本低，提取过程无需再纯化，缩减了提取步骤，降底了提取成本，适用于各种水体微生物的多样性分析。

Method for extracting microbial DNA in water body

A method for extraction of microbial DNA in water, using sterile millipore filter for collecting microorganisms, disruption of microbial cells by physical and chemical methods, followed by potassium acetate, humic acid and other impurities removal of guanidinium thiocyanate, sodium citrate and other reagents, the cell lysates were multiple centrifugation, finally using ethanol and potassium acetate extraction by microorganism genomic DNA purification, microbial DNA extraction has good integrity, high purity, high yield, the ratio of OD260/OD280 in 1.8 ~ 2, by agarose gel electrophoresis after staining, DNA bands were clear and single, no tail, no impurity band, the microbial DNA high yield, simple operation and low cost the extraction process, without further purification, reduced the extraction steps, low extraction cost, suitable for all kinds of water microbial diversity analysis.

【技术实现步骤摘要】
一种水体中微生物DNA的提取方法
本专利技术属于分子生态学领域，具体地涉及一种水体中微生物DNA的提取方法。
技术介绍
水体中含有非常丰富的微生物资源，传统的纯培养技术主要是把微生物通过选择性培养基分离培养后，再进行纯菌的分类鉴定。利用传统的纯培养技术，淡水环境中大概0.25％的微生物可以培养，海水环境中大约0.001～0.1％的微生物可培养，不仅费时、费力，只能检测可培养微生物，对水体中大量的不可培养的微生物无法分析，这给微生物多样性资源开发和利用带来很大局限。但近年来，各种分子生物学方法(PCR、克隆文库、DGGE等)相继应用到微生物生态学中，这些技术能快速地分析微生物群落结构的多样性，进行复杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态性、以及重要基因定位、表达及调控的评价分析，更好地揭示微生物与环境之间的生态学意义。而以上方法的关键技术之一是从各种水体样品中获得高纯度、大片段、完整性好的水体微生物DNA。由于水体样品种类繁多，成分复杂，含有大量的无机和有机化合物，尤其是水体环境中天然有机质腐殖酸和重金属会干扰提取反应和后续的PCR酶反应的进行，此外，粗提DNA的每一个纯化步骤，不可避免的会引起DNA损失。因此，需要研究适用于水体微生物多样性分析的DNA提取的方便、快捷、实用的方法，以解决常规方法所获得的DNA样品存在腐殖酸等PCR抑制剂、细胞裂解率低、DNA损失严重等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种水体中微生物DNA的提取方法，适用于各种水体微生物的多样性分析，提取过程不使用酚、氯仿，减少对实验操作人员的危害，所提取的微生物DNA具有较好的完整性，经琼脂糖凝胶电泳后染色，DNA条带清晰且单一，无拖尾，无杂带，获得的微生物DNA纯度高、产量高、操作简单、成本低。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：一种水体中微生物DNA的提取方法，包括如下步骤：1)收集微生物将水样经微孔滤膜过滤，收集滤膜，在无菌条件下，将滤膜剪碎，放入离心管；2)破碎微生物细胞向步骤1)的离心管中加入氧化锆、试剂I、试剂II，震荡，离心，取上清液；其中，所述的试剂I为0.2～0.3M磷酸缓冲液，pH＝7.0～8.0；所述试剂II包括：1～2wt.％SDS细胞裂解液，20～60mMTris-HCl，100～200mMNaCl，40～100mMEDTA，0.1～1wt.％乙烯聚吡咯烷酮，pH＝7.8～8.0；3)去除腐殖酸和蛋白质向步骤2)的上清液中加入试剂III，混匀，离心，向离心后的上清液中加入试剂IV，混匀，离心，得到裂解液；其中，所述的试剂III为80～120mM硫酸铝；试剂IV中含有浓度为2～5M的醋酸钾、2～6wt.％的冰醋酸，pH＝4.6～5.0；4)纯化裂解液将裂解液的上清液中加入试剂V，混匀，移入核酸纯化柱中，静置，离心，弃去虑液；向核酸纯化柱中加入试剂VI，离心，弃去滤液，再加试剂VII，离心，弃去滤液；其中，利用试剂VII纯化2～3次；其中，所述的试剂V中含有：6～10M异硫氰酸胍，0.2～0.6M醋酸钾；试剂VI中含有：6～10M异硫氰酸胍，20～23mM柠檬酸钠；试剂VII中含有：70～75％乙醇，体积分数；5)洗脱DNA将核酸纯化柱安置于离心管内，离心，向核酸纯化柱中加入灭菌蒸馏水，室温静置，将静置后获得的洗脱液进行离心，获得所述微生物DNA。进一步，步骤2)所述氧化锆的粒径为1.0～1.2mm。优选地，所述试剂I为0.2～0.3M磷酸缓冲液，pH＝7.0～8.0；所述试剂II包括：1.4～1.6wt.％SDS细胞裂解液，30～50mMTris-HCl，140～160mMNaCl，60～80mMEDTA，0.4～0.6wt.％乙烯聚吡咯烷酮，pH＝7.85～7.95。优选地，步骤3)所述的试剂III包括：90～110mM硫酸铝；所述试剂IV包括：3～4mol/L的醋酸钾、3～5wt.％的冰醋酸，pH＝4.7～4.9。优选地，步骤4)所述的核酸纯化柱是含有聚丙烯膜+硅胶膜的核酸纯化柱。优选地，所述步骤5)中洗脱DNA时，灭菌蒸馏水加热至60～65℃。进一步，将获得的DNA保存于-20～-18℃。进一步，所述水样的体积为50～100ml，所述的氧化锆的加入量为0.8～1.0g，水样和试剂I的体积比为40～50:1，所述的试剂I、试剂II、试剂III、试剂IV、试剂V、试剂VI和试剂VII之间的体积比为1：0.15～0.2：0.15～0.2：0.3～0.4：1～1.2：0.4～0.6：0.4～0.6。本专利技术采用利用物理和化学方法破碎微生物细胞，在物理破碎时，比重越大的研磨珠，冲量越大，研磨效率越高，破碎效果越好，相对于玻璃珠和硅酸锆，氧化锆比重最大，密度和强度最高，抗破裂性强；同时研磨珠的大小决定了研磨珠和物料的接触点的多少，粒径小的珠子在相同的容积下接触点越多，理论上研磨效率也越高；采用粒径为1.0～1.2mm的氧化锆，可以充分破碎水体中微生物细胞壁和细胞膜，使得细胞内的物质包括DNA最大程度释放。本专利技术进行化学破碎时，试剂II中除了含有SDS细胞裂解液，还加入了浓度为0.1～1％的乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)，可以去除细胞内的酚类和萜类杂质，在提高细胞裂解率同时，提高DNA纯度。本专利技术利用硫酸铝和醋酸钾试剂去除腐殖酸和蛋白质，加入试剂III去除水体中的腐殖酸，试剂III中硫酸铝的浓度过高或过低均会影响腐殖酸的去除效率，设定硫酸铝浓度为80～120mM时，去除腐殖酸的效果最佳，可以完全去除腐殖酸，同时不影响DNA的收率；加入试剂IV沉淀去除细胞中的蛋白杂质，试剂IV中添加冰醋酸，其作用是调节pH到4.6～5.0，试剂IV中醋酸钾的浓度是2～5M、冰醋酸的浓度是2～6wt.％，在此浓度及pH下，去除蛋白杂质效果最佳。本专利技术对获得的裂解液纯化时，利用核酸纯化柱进行纯化，使用聚丙烯膜+硅胶滤膜的纯化柱，相对于常规的纯化柱，聚丙烯膜+硅胶滤膜韧性好，抗拉强度较高，在高速离心状态下，能保持其性能；在高盐条件下，核酸纯化柱的滤膜可以同核酸发生吸附反应，而在低盐条件下，核酸又可以从滤膜中释放出来，蛋白质和其它杂质不会被吸附，从而达到纯化核酸的目的。本专利技术的试剂V中含有异硫氰酸胍和醋酸钾，能够破坏核酸表面亲水薄膜的相对有序排列，形成疏水环境，在此环境中，核酸与硅胶膜能有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能结合，因此加入试剂V的作用是促进DNA与硅胶模的结合，使DNA吸附到硅胶模上，试剂V中异硫氰酸胍的浓度是6～10M，醋酸钾的浓度是0.2～0.6M时，这样的浓度范围可以促进DNA与硅胶模的结合效果最好。本专利技术利用试剂VI、试剂VII对裂解液进行纯化，洗脱DNA有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸，试剂VI、试剂VII中成分的浓度范围可以保证洗脱DNA小分子杂质，而DNA继续吸附在硅胶模表面，保持较好的DNA较好的纯度，在洗脱DNA时，使用加热的灭菌蒸馏水，有利于提高洗脱效率。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1)本专利技术提取水体样品的微生物DNA，纯度高、产量高，采用分光光度计分别在260nm和280nm测定微生物DNA的吸光度，其OD260和OD280比值在1.8～2.0之间，测得微生物DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水体中微生物DNA的提取方法，包括如下步骤：1)收集微生物将水样经微孔滤膜过滤，收集滤膜，在无菌条件下，将滤膜剪碎，放入离心管；2)破碎微生物细胞向步骤1)的离心管中加入氧化锆、试剂I、试剂II，震荡，离心，取上清液；其中，所述的试剂I为0.2～0.3M磷酸缓冲液，pH＝7.0～8.0；所述的试剂II包括：1～2wt.％SDS细胞裂解液，20～60mM Tris‑HCl，100～200mM NaCl，40～100mM EDTA，0.1～1wt.％乙烯聚吡咯烷酮，pH＝7.8～8.0；3)去除腐殖酸和蛋白质向步骤2)的上清液中加入试剂III，混匀，离心，向离心后的上清液中加入试剂IV，混匀，离心，得到裂解液；其中，所述的试剂III为80～120mM硫酸铝；所述的试剂IV中含有浓度为2～5M的醋酸钾、2～6wt.％的冰醋酸，pH＝4.6～5.0；4)纯化裂解液将裂解液的上清液中加入试剂V，混匀，移入核酸纯化柱中，静置，离心，弃去虑液；向核酸纯化柱中加入试剂VI纯化，离心，弃去滤液，再加试剂VII纯化，离心，弃去滤液；其中，利用试剂VII纯化2～3次；其中，所述的试剂V中含有：6～10M异硫氰酸胍，0.2～0.6M醋酸钾；所述的试剂VI中含有：6～10M异硫氰酸胍，20～23mM柠檬酸钠；所述的试剂VII中含有：70～75％乙醇，体积分数；5)洗脱DNA将核酸纯化柱安置于离心管内，离心，向核酸纯化柱中加入灭菌蒸馏水，室温静置，将静置后获得的洗脱液进行离心，获得所述微生物DNA。...

【技术特征摘要】
1.一种水体中微生物DNA的提取方法，包括如下步骤：1)收集微生物将水样经微孔滤膜过滤，收集滤膜，在无菌条件下，将滤膜剪碎，放入离心管；2)破碎微生物细胞向步骤1)的离心管中加入氧化锆、试剂I、试剂II，震荡，离心，取上清液；其中，所述的试剂I为0.2～0.3M磷酸缓冲液，pH＝7.0～8.0；所述的试剂II包括：1～2wt.％SDS细胞裂解液，20～60mMTris-HCl，100～200mMNaCl，40～100mMEDTA，0.1～1wt.％乙烯聚吡咯烷酮，pH＝7.8～8.0；3)去除腐殖酸和蛋白质向步骤2)的上清液中加入试剂III，混匀，离心，向离心后的上清液中加入试剂IV，混匀，离心，得到裂解液；其中，所述的试剂III为80～120mM硫酸铝；所述的试剂IV中含有浓度为2～5M的醋酸钾、2～6wt.％的冰醋酸，pH＝4.6～5.0；4)纯化裂解液将裂解液的上清液中加入试剂V，混匀，移入核酸纯化柱中，静置，离心，弃去虑液；向核酸纯化柱中加入试剂VI纯化，离心，弃去滤液，再加试剂VII纯化，离心，弃去滤液；其中，利用试剂VII纯化2～3次；其中，所述的试剂V中含有：6～10M异硫氰酸胍，0.2～0.6M醋酸钾；所述的试剂VI中含有：6～10M异硫氰酸胍，20～23mM柠檬酸钠；所述的试剂VII中含有：70～75％乙醇，体积分数；5)洗脱DNA将核酸纯化柱安置于离心管内，离心，向核酸纯化柱中加入灭菌蒸馏水，室温静置，将静置后获得的洗脱液进行离心，获得所述微生物DNA。2.根据权利要求1所述的水体中微生物DNA的提取方法，其特征在于，步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏，唐雪明，潘爱虎，赵凯，蒋玮，王金斌，武国干，吕贝贝，吴潇，贾军伟，王荣谈，白蓝，刘华，王慧，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31