酶引发的自由基聚合反应及检测应用制造技术

本发明专利技术提供一种新型的信号放大体系和方法，可以用于化学生物医学检测。本发明专利技术利用过氧化物酶和G四链体过氧化物酶构建自由基引发体系，用于引发自由基聚合，并利用聚集诱导发光实现荧光信号放大。本体系可以实现对核酸的检测和适配体靶标的检测。本方法可以在荧光定量PCR仪上使用，通过荧光信号获得检测物浓度。相对于PCR、滚环扩增等核酸扩增的方法，本方法不涉及核酸扩增的过程，因而不需要DNA聚合酶等价格昂贵的试剂，也不存在核酸的非特异性扩增的问题。本方法还可以与酶联免疫法、ELISA和核酸扩增等方法联用，实现多轮信号放大，并用于抗体抗原的检测。

Free radical polymerization induced by enzyme and its detection and Application

The invention provides a new signal amplifying system and method, which can be used for chemical biomedicine detection. The invention uses superoxide peroxidase and G four strand peroxidase to construct free radical initiation system, which is used for initiating free radical polymerization, and realizes the amplification of fluorescent signals by using aggregation induced luminescence. This system can detect nucleic acid and detect aptamer targets. This method can be used in fluorescent quantitative PCR, and the detection concentration is obtained by fluorescence signal. Compared with the PCR method, such as rolling circle amplification of nucleic acid amplification, this method does not involve the process of nucleic acid amplification reagent, which does not require DNA polymerase were expensive, there is no nonspecific amplification of nucleic acids. The method can also be used in combination with enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA and nucleic acid amplification to achieve multi wheel signal amplification and is used for antibody antigen detection.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术利用酶引发自由基聚合反应来实现检测信号的放大，属于生物检测、荧光检测领域。
技术介绍
荧光传感因为灵敏度高、样品用量少，在化学、生物检测及临床医学诊断方面应用非常广泛。荧光传感离不开荧光探针的设计与合成，荧光探针可以与样本中的目标分子结合或发生化学反应，从而使探针分子的荧光发生改变，再通过仪器或肉眼观察即可判断样本中目标分子的含量。为了提高荧光信号的强度，一般将酶反应或者催化剂引入到检测体系中，使荧光信号放大，从而提高检测的灵敏度。酶联免疫法，包括酶联免疫吸附测定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)在分析化学领域中应用广泛，已经成为抗体抗原检测的主要方法之一。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。其检测原理和过程为：首先使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；其次使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性；在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故有信号放大的效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。核酸扩增是核酸聚合酶催化的特殊聚合反应，在检测信号放大中应用广泛。根据核酸扩增反应中温度变化要求，可以将核酸扩增技术分为两大类：一类是聚合酶链式反应（PCR）技术，另一类是核酸恒温扩增技术。无论是PCR技术还是恒温扩增技术，它们信号放大的本质都是扩增特定序列的DNA片段，能将微量的DNA数量级倍扩增，从而大大提高检测灵敏度。一个PCR反应需要以下几种物质的参与：模板序列，引物序列，DNA聚合酶，核苷酸单体。模板序列为需要被放大的DNA序列，含量很少，其他三种物质都是足量的。在一轮扩增反应中，引物与模板结合后在聚合酶催化下，与核苷酸单体发生聚合反应，形成新的DNA链可以做为下一轮扩增反应的模板，因而每一轮扩增之后，模板数量翻倍，十几轮扩增后模板DNA数量增加了几千上万倍，结合双链DNA染料后荧光显著增加。核酸等温扩增技术是在PCR技术基础上发展的核酸扩增技术，如链替代等温扩增、滚环扩增及环介导等温扩增等，这些扩增技术同样用到模版序列和DNA聚合酶，及核苷酸单体等，恒温扩增技术在实际操作和仪器要求方面比PCR技术更为简单方便，近些年在核酸检测领域也有许多发展和应用（参考文献：Chem.Rev.2015,115,12491−12545；J.Am.Chem.Soc.2004,126,7430-743等）。正因为PCR等核酸扩增技术的序列特异性及扩增的高效性，这些技术可以用于非常微量的核酸序列检测，已经在医学临床诊断和刑事侦查鉴定中有，例如传染病病原体的确认、亲子鉴定等。近些年结合核酸适配体技术，PCR等核酸扩增技术不仅用于序列特异性的检测，还用于各种适配体靶标的检测（如蛋白质、小分子、金属离子等）。一种具体的实施方式为：适配体与靶标分子结合之后，核酸二级结构发生变化，释放了核酸扩增的模板，使PCR等核酸扩增反应得以进行（参考中国专利：申请号：2004800276961、2008100276529、2013106651410、2012105913322等）。然而，PCR等核酸扩增技术也存在各种问题，核酸扩增技术的序列特异性不是绝对的，样品易污染，不同的核酸序列存在扩增差异，还存在非特异性扩增、脱靶效应等，因而会造成假阳性的结果。在临床检测中，为了避免样本的污染，国内外法律严格规定PCR反应需要由四个无菌实验室进行。其中我国《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》明确规定：原则上临床基因扩增检验实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。这使得PCR检测的成本及操作的复杂性大大增加。此外基于核酸扩增技术对引物设计，聚合酶和核苷酸单体（dNTP）等试剂的要求较高，也提高了检测价格。为了简化操作、降低成本，急发展需其他的信号放大方式来弥补PCR等核酸扩增反应的不足。无论是核酸扩增还是酶联免疫法，都是将酶等催化剂引入检测体系。因而发展新型的催化剂并将其引入检测体系中，就有望获得新的信号放大方式。Fenton反应由法国科学家Fenton发现，主要反应过程是过氧化氢被亚铁或铁离子催化分解生成羟基自由基（参考文献：环境化学，2006，25，《Fenton及Photo-Fenton反应研究进展》）。后来的研究发现：许多其它金属离子也能够催化该反应，如Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Mo等金属元素的离子，并且，当一些金属离子与有机配体结合形成配合物之后（包括金属卟啉、金属酞菁、金属希夫碱等配合物），催化活性可显著提高。最近几十年的研究表明，上述一些金属配合物与蛋白质或者核酸等生物分子结合之后，催化活性又有显著提高。一个典型的例子是过氧化物酶，过氧化物酶种类繁多，以辣根过氧化物酶的研究应用最为广泛。辣根过氧化物酶（HRP，EC.1.11.1.7）是一种来源广泛的植物过氧化物酶，该酶由多肽链包裹血红素构成，它可以在非常温和的条件（常温常压和中性pH）下高效催化过氧化氢生成羟基自由基。另外一个提高金属配合物过氧化物酶活性的方法是将配合物与核酸链结合。许多文献报道血红素可以与G四链体结构的DNA形成特异结合，并且该复合物具有过氧化物酶活性（参考文献Chem.Biol.1998,5,505-517；Chem.Biol.1999,6,779-787），在一定条件下可以产生自由基（参考文献：J.Am.Chem.Soc.2001,123,1337-1348），进而可以通过自由基反应使一些物质颜色改变或出现化学发光。此外能够形成G四链体的DNA在溶液中会存在两种状态：一种是无规则结构，不能结合血红素等配合物；另一种是G四链体结构。这两种结构可以在一定条件下相互转换。利用这种性质可以设计出各种以G四链体为基础的分子元件，并应用于核酸杂交的检测以及适配体传感器的构建（参考文献：Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2008,47,3927-3931；J.Am.Chem.Soc.2004,126,7430-7431；Anal.Chem.2009,81,2144-2149；Chembiochem.2004,5,374-379；Acc.Chem.Res.,2013,46，203–213；Chem.Rev.,2009,109,1948–1998；Chem.Rev.,2014,114,2881–2941）。无论是Fenton反应（包括改进的Fenton反应，以及金属配合物催化的Fenton反应），还是过氧化物酶催化反应，又或者是G四链体与血红素的复合物的催化反应，催化速率虽然各不相同，但是这些本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种信号放大的检测体系，组成包括：荧光分子、单体分子、过氧化物酶；所使用的荧光分子种类不限于一种，荧光分子的特征在于：分子中含有苯乙烯单元，还含有具有结合功能的基团，二者通过共价键连接或者有机单元桥连；所使用的单体分子种类不限于一种，单体分子的特征在于：分子中含有反应官能团，反应官能团选自：烯、炔、呋喃、苯胺、苯酚、巯基、环烷、含杂原子的环烷等；所使用的单体中，其中至少有一种符合以下特征：除含有上述反应官能团外，还含有具有结合功能的基团，二者通过共价键连接或者有机单元桥连；荧光分子和单体分子上的具有结合功能的基团各自独立，选自：羧基、磺酸基、磷酸基、磷酸酯基、连有芳香环的羟基、羟基、硼酸基、芳香环取代的硼酸基、氨基、胺基、含取代基的胺基、亚胺基、肟基、胍基、含取代基的胍基、膦基、含氮杂环的季铵盐、含金属的配合物基、含芳香环的基团、容易形成氢键的基团、巯基等；荧光分子和单体分子的结合基团可以通过疏水作用、π‑π作用、静电作用、配位作用、氢键作用、可逆共价键结合起来；过氧化物酶选自蛋白质构成的过氧化物酶或核酸构成的过氧化物酶；该体系特征在于：在没有酶底物的时候，荧光分子分散游离，荧光很弱；当有底物时，过氧化物酶可以催化底物形成自由基，进而引发单体分子的自由基聚合反应，进而使荧光分子聚集在聚合产物上，并导致荧光分子的荧光增强。...

【技术特征摘要】
1.一种信号放大的检测体系，组成包括：荧光分子、单体分子、过氧化物酶；所使用的荧光分子种类不限于一种，荧光分子的特征在于：分子中含有苯乙烯单元，还含有具有结合功能的基团，二者通过共价键连接或者有机单元桥连；所使用的单体分子种类不限于一种，单体分子的特征在于：分子中含有反应官能团，反应官能团选自：烯、炔、呋喃、苯胺、苯酚、巯基、环烷、含杂原子的环烷等；所使用的单体中，其中至少有一种符合以下特征：除含有上述反应官能团外，还含有具有结合功能的基团，二者通过共价键连接或者有机单元桥连；荧光分子和单体分子上的具有结合功能的基团各自独立，选自：羧基、磺酸基、磷酸基、磷酸酯基、连有芳香环的羟基、羟基、硼酸基、芳香环取代的硼酸基、氨基、胺基、含取代基的胺基、亚胺基、肟基、胍基、含取代基的胍基、膦基、含氮杂环的季铵盐、含金属的配合物基、含芳香环的基团、容易形成氢键的基团、巯基等；荧光分子和单体分子的结合基团可以通过疏水作用、π-π作用、静电作用、配位作用、氢键作用、可逆共价键结合起来；过氧化物酶选自蛋白质构成的过氧化物酶或核酸构成的过氧化物酶；该体系特征在于：在没有酶底物的时候，荧光分子分散游离，荧光很弱；当有底物时，过氧化物酶可以催化底物形成自由基，进而引发单体分子的自由基聚合反应，进而使荧光分子聚集在聚合产物上，并导致荧光分子的荧光增强。2.如权利要求1所述的检测体系，单体分子的优选结构有：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、。3.如权利要求1所述的检测体系，所使用的荧光分子的特征在于：分子中含有以苯乙烯为子单元的荧光基团，还含有具有结合功能的基团，二者通过共价键连接或者有机单元桥连；其中，荧光基团优选结构如下：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、。4.如权利要求3所述的检测体系，所使用的荧光分子的特征在于：分子中含有以苯乙烯为子单元的荧光基团，还含有具有结合功能的基团，二者通过共价键连接或者有机单元桥连；荧光分子的优选结构有：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、。5.一种荧光检测信号放大体系，组成包括：单体分子、过氧化物酶；所使用的单体分子种类不限于一种，单体分子的特征在于：分子中含有反应官能团，反应官能团选自：烯、炔、呋喃、苯胺、苯酚、巯基、环烷、含杂原子的环烷等；所使用的单体中，其中至少有一种为荧光单体分子，荧光单体分子的特征在于：分子中含有苯乙烯单元，还含有反应官能团，二者通过共价键连接或者有机单元桥连；其中，反应官能团选自：烯、炔、呋喃、苯胺、苯酚、巯基、环烷、含杂原子的环烷等；过氧化物酶选自蛋白质类过氧化物酶或核酸类过氧化物酶；该体系特征在于：在没有酶底物的时候，荧光单体分子分散游离，荧光很弱；当有底物时，过氧化物酶可以催化底物形成自由基，进而引发荧光单体分子的聚合反应，进而使荧光基团的分子运动受限制，并导致荧光增强。6.如权利要求5所述的检测体系，所使用的荧光单体分子的特征在于：分子中含有以苯乙烯为子单元的荧光基团，还含有反应官能团，二者通过共价键连接或者有机单元桥连；其中，荧光基团优选结构如权利要求3所述。7.如权利要求6所述的检测体系，所使用的荧光单体分子的优选结构有：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、。8.一种检测信号放大体系，组成包括：单体分子、过氧化物酶；所使用的单体分子种类不限于一种，单体分子的特征在于：分子中含有反应官能团，反应官能团选自：烯、炔、呋喃、苯胺、苯酚、巯基、环烷、含杂原子的环烷等；过氧化物酶选自蛋白质类过氧化物酶或核酸类过氧化物酶；该体系特征在于：在没有酶底物的时候，单体分子分散游离，溶液粘度小；当有底物时，过氧化物酶可以催化底物形成自由基，进而引发单体分子的聚合反应，进而使溶液粘度增加甚至形成凝胶状；即依据溶液粘度的变化可以检测底物的存在。9.一种荧光检测信号放大体系，其组成除了包括如权利要求1所述的荧光分子、单体分子、过氧化物酶之外，还包括以下一种或几种物质：自由基引发剂、链转移剂、稳定自由基、稳定自由基前体、荧光猝灭剂；自由基引发剂特征在于能够发生反应，生成自由基，这类试剂选自偶氮化物、叔胺、过氧化物、过氧酸、过氧酸酯、过硫酸盐等常用的引发剂；链转移剂的特征在于能够与自由基发生自由基转移反应，抑制活性自由基的链终止反应，增加单体反应的转化率；这类物质选自巯基化合物、β-二酮等常用的链转移剂；稳定自由基或稳定自由基前体，特征在于：这些物质或者这些物质形成的自由基可以与链增长的自由基发生可逆的链终止或加成消除反应，用于抑制链转移和链终止反应，实现活性自由基聚合，提高聚合反应的聚合度；这类物质选自胺氧自由基、烷氧胺、黄原酸酯、碘化物、碘等；荧光猝灭剂可以在聚合反应前与荧光分子形成非共价的超分子复合物，通过能量共振转移或者电子转移机理猝灭荧光分子的荧光，从而降低本底荧光。10.一种荧光检测信号放大体系，其组成包括权利要求5所述的单体分子、过氧化物酶之外，还包括以下一种或几种物质：自由基引发剂、链转移剂、稳定自由基、稳定自由基前体、荧光猝灭剂；这些试剂的特征如权利要求9所述。11.一种检测信号放大体系，其组成包括权利要求8所述的单体分子、过氧化物酶之外，还包括以下一种或几种物质：自由基引发剂、链转移剂、稳定自由基、稳定自由基前体；这些试剂的特征如权利要求9所述。12.如果权利要求1至11所述的检测体系，过氧化物酶选自蛋白质构成的过氧化物酶，这些酶来源于生物中。13.如权利要求12所述的检测体系，过氧化物酶选自植物过氧化物酶。14.如权利要求13所述的检测体系，过氧化物酶为辣根过氧化物酶。15.如权利要求1至11所述的检测体系，该体系应用于过氧化物酶底物的检测。16.如权利要求1至11所述的检测体系，与氧化酶联用，应用于氧化酶底物的检测；与氧化酶联用的体系特征为，不含过氧化物，含有氧化酶；检测过程是：氧化酶可以催化底物，生成过氧化物，进而被体系中过氧化物酶催化形成自由基，进而引发单体分子的聚合反应，通过溶液粘度或荧光增强判断底物的存在。17.如权利要求1至11所述的检测体系，与氧化酶底物联用，应用于氧化酶活性的检测；与氧化酶底物联用的体系特征为，不含过氧化物，含有氧化酶底物；检测过程是：氧化酶可以催化底物，生成过氧化物，进而被体系中过氧化物酶催化形成自由基，进而引发单体分子的聚合反应，通过溶液粘度或荧光增强判断氧化酶的活性大小。18.一种检测信号放大体系，组成选自如权利要求1至11中任意一种检测体系，其中所用过氧化物酶选自核酸构成的过氧化物酶；该过氧化物酶的特征在于：由可形成G四链体结构的核酸与配合物结合构成；可形成G四链体结构的核酸可以是一条或者多条，它们的序列通式如下：序列1：G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG(X2……Y2)G(G)mG(X3……Y3)G(G)mG；序列2：G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG(X2……Y2)G(G)mG；序列3：G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG；序列4：G(G)mG上述通式中，子序列G(G)mG被子序列(X1……Y1)、(X2……Y2)、(X3……Y3)隔开，其中子序列(X1……Y1)、(X2……Y2)、(X3……Y3)各自独立选自长度为1-20个碱基的核酸序列，其中的每个碱基各自独立选自核酸碱基A、T、G、C、U及其他可以形成氢键配对的修饰的碱基和非天然碱基，m选自0到10的整数；其中序列1只需要一条就可以形成G四链体，序列2、3、4相互组合可以形成G四链体；所用的配合物特征在于：能够与G四链体核酸发生特异结合；配合物选自卟啉和类卟啉配合物、希夫碱（salphen）和类希夫碱配合物、三联吡啶和类三联吡啶配合物、以及其它能够结合G四链体的配合物等；该检测体系特征是：上述核酸在...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱泽策，朱应竹，徐黎，
申请(专利权)人：朱泽策，
类型：发明
国别省市：湖北;42