The invention discloses a nano gold color in response to Vibrio parahaemolyticus detection method based on isothermal nucleic acid amplification; TLH gene primers designed by biotinylated, by loop mediated isothermal amplification rapid amplification of TLH gene amplification technology, the process produces a large amount of labeled with biotin streptavidin will repeat, nano gold in the modified fast aggregation, and has the color change effect strong, to achieve the purpose of detecting specific genes. The present invention establishes Vibrio parahaemolyticus in aquatic products economy, rapid and accurate, specific, sensitive and simple detection method, improve the medical health examination, disease prevention, aquatic products processing and import and export inspection and other departments of the detection quality and efficiency.
【技术实现步骤摘要】
基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法
本专利技术属于食品病害微生物检测领域,具体涉及一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是革兰氏阴性嗜盐细菌,隶属弧菌科中的弧菌属。它是近海的鱼类、虾类、蟹类、贝类等海产品中的重要的食源性致病菌之一,属人畜共患病菌,在水产品中的污染状况非常严重,是沿海地区食物中毒和夏季腹泻的重要病原菌。为确保食品安全,保护人民身体健康,欧盟、美国等发达国家对水产品中的副溶血性弧菌做出了明确的规定,如欧盟规定副溶血性弧菌不得检出,而美国规定<1×104/g。我国已将该菌列为主要的检验或监测对象。目前,该菌是多数进出口水产品必检的致病菌之一。自2001年以来,副溶血性弧菌性食物中毒爆发已经成为中国最常见的食源性疾患,副溶血性弧菌性食物中毒的起数和人数一直处于第一位。使用传统的检测方法即非选择性和选择性增菌、生长法及血清学鉴定虽然比较准确,但检测周期长、工作量大,繁琐费时。不仅如此,低水平的病原菌污染,食品加工后导致菌体的“致伤”及食品其它成分的干扰等因素,使得传统的检测方法受到了一定的限制,因此,急需一些灵敏度更高、特异性更强、简便、快捷的水产品安全检测技术,以及时发现致病微生物,控制污染及其可能对人体健康产生的危害。科技创新产生了一系列新型的检测方法,如核酸分子扩增检测技术、免疫检测、生物传感等技术,为微生物、病毒的检测提供了新的手段,在食品安全检测中发挥了重要作用。免疫荧光技术(FAT)、酶联免疫吸附(ELISA)、分子检测技术( ...
【技术保护点】
一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:S1、制备链霉亲和素标记的纳米金;S2、对样品进行采集、增菌后,提取DNA;S3、以所述DNA为扩增模板进行环介导等温扩增;S4、取所述链霉亲和素标记的纳米金加入步骤S3扩增完成的反应溶液体系,反应后观察反应体系溶液;如反应体系溶液产生明显的由红向蓝的变化过程,则代表样品中检测出了副溶血性弧菌,如反应体系溶液未发生由红向蓝的变色过程,则代表样品中无副溶血性弧菌。
【技术特征摘要】
1.一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:S1、制备链霉亲和素标记的纳米金;S2、对样品进行采集、增菌后,提取DNA;S3、以所述DNA为扩增模板进行环介导等温扩增;S4、取所述链霉亲和素标记的纳米金加入步骤S3扩增完成的反应溶液体系,反应后观察反应体系溶液;如反应体系溶液产生明显的由红向蓝的变化过程,则代表样品中检测出了副溶血性弧菌,如反应体系溶液未发生由红向蓝的变色过程,则代表样品中无副溶血性弧菌。2.根据权利要求1所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法,其特征在于,步骤S1中,链霉亲和素标记的纳米金的制备包括如下步骤:A1、调节纳米金溶液在450nm处的吸光度值在1.5-2.0;A2、以0.1mol/L的K2CO3或0.1mol/L的HCl溶液将纳米金溶液调节至pH=7~8。A3、将链霉亲和素稀释成一系列5~40μg/mL溶液,每1mL的纳米金溶液中分别加入0.1mL,混匀静置后,加入0.1mL10%的NaCl溶液,混匀静置,随着链霉亲和素的用量的增加,纳米金溶液由蓝色变为红色;选择由蓝色变为红色的链霉亲和素用量1.1倍作为最佳蛋白标记比例;A4、每10mL的经步骤A1和A2调节好的纳米金溶液中,加入所述最佳蛋白标记比例的链霉亲和素溶液,混匀后加入0.1mL10%PEG20000溶液再次混匀;A5、离心分离后,将底层悬浮液用0.5mg/mLPEG20000溶液重新离心沉淀,恢复后加入0.1mg/mL叠氮化钠后冷藏保存待用。3.根据权利要求1所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法,其特征在于,步骤S2中,所述提取包括:将过夜培养的增菌液混匀后静置,吸取菌悬液每5mL,加入无菌离心管中,以8000~12000r/min离心,弃去上清液,加入0.5~2mLTZ裂解液悬浮菌体。4.根据权利要求3所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法,其特征在于,所述TZ裂解液的配制包括:2.0%TritonX-100,2.5mg/mL的叠氮化钠,0.1mol/LTris-HCl缓冲液,pH8.0;沸水浴10min,置冰上10min,然后10000r/min离心5min,冷冻保存待用。5.根据权利要求1所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法,其特征在于,所述环介导等温扩增中采用的针对副溶血性弧菌的tlh基因的特异性标记引物的序列如SEQIDNO.1~SEQIDNO.4所示;采用的针对副...
【专利技术属性】
技术研发人员:孔聪,沈晓盛,王媛,史永富,刘志东,
申请(专利权)人:中国水产科学研究院东海水产研究所,
类型:发明
国别省市:上海,31
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