产酸克雷伯菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种产酸克雷伯菌及其催化α‑氨基腈(2‑氨基‑4(羟乙基甲基磷酰基)‑丁腈)制备作为L‑草铵膦重要手性前体的L‑2‑氨基‑4(羟乙基甲基磷酰基)‑丁酸中的应用，本发明专利技术提供了一株能够产腈水解酶的菌株‑‑产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)ZJB‑16005，本发明专利技术还提供了利用产酸克雷伯菌ZJB‑16005经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂催化2‑氨基‑4(羟乙基甲基磷酰基)‑丁腈制得作为L‑草铵膦重要手性前体的L‑2‑氨基‑4(羟乙基甲基磷酰基)‑丁酸的方法，具有重要应用前景。

Klebsiella and its application

The invention discloses a Klebsiella oxytoca and catalytic alpha amino nitrile (2 amino 4 (hydroxyethyl methyl phosphoryl) Ding Jing) were prepared as L important chiral precursor L glufosinate 2 amino 4 (hydroxyethyl methyl phosphoryl) butyric acid in the application. The invention provides an nitrilase producing strains of Klebsiella oxytoca (Klebsiella oxytoca ZJB) 16005, the invention also provides the use of Klebsiella oxytoca ZJB 16005 wet cell obtained by fermenting and culturing biological catalyst 2 amino (4 hydroxyethyl methyl phosphoryl Ding Jing) prepared as L important chiral precursor L glufosinate 2 amino 4 (hydroxyethyl methyl phosphoryl) method butyric acid, has important application prospect.

【技术实现步骤摘要】
产酸克雷伯菌及其应用(一)
本专利技术涉及一株产腈水解酶的菌株，及其在生物催化α-氨基腈底物(2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁腈)制备作为L-草铵膦重要手性前体的L-2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁酸的应用。(二)
技术介绍
腈水解酶(Nitrilase，EC3.5.5.1)能将腈类化合物中的氰基直接转化为羧基制备羧酸，它对腈化合物具有独特的化学选择性、立体选择性和区域选择性，可以用于合成多种化学法合成效率低下或难以合成的羧酸。其选择性好，转化率高，同时，该途径与传统工艺相比具有反应条件温和，无需高温高压、强酸强碱，污染较少，有着化学方法无可比拟的优越性，符合原子经济型和绿色化学的发展方向，在化学合成中表现出巨大的应用潜力，无论在应用数量还是种类上都有较大发展，在医药及其中间体、农药及其中间体、食品及饲料添加剂等领域得到了广泛应用：腈水解酶催化制备瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)的关键中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯；制备抗血小板聚集药物氯吡格雷(Clopidogrel)的关键中间体R型邻氯扁桃酸；制备IDA路线生产除草剂草甘膦的关键中间体亚氨基二乙酸等。L-2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁酸是制备L-草铵膦的重要手性前体。DL-草铵膦，有效成分是phosphinothricin(简称PPT)，其化学名称为：4-[羟基甲基膦酰基]-DL-高丙氨酸(别名：D,L-草铵膦胺盐)，为广谱、触杀型、灭生性、非残留除草剂，是由德国赫斯特公司(目前为拜耳公司旗下企业)于20世纪80年代开发的新型灭生性除草剂。除了具有除草活性外还具有杀虫杀菌活性可以与杀虫剂等混配达到同时防治的效果。该除草剂具有高效、低毒、易降解等特点。草铵膦是外消旋体混合物，只有L–型具有植物毒性，其除草活性为外消旋混合物的2倍。目前，市售的草铵膦一般都是外消旋混合物，如果能以L-型的草铵膦来代替其使用，不仅可以降低使用成本，还能减轻环境压力。草铵膦的合成方法有很多，包括化学法合成外消旋草铵膦：盖布瑞尔(Gabriel)–丙二酸二乙酯合成法、阿布佐夫(Arbuzov)合成法、高压催化合成法、赫勒-贝格斯(Bucherer-Bergs)法、赫勒-贝格斯(Bucherer-Bergs)法、(Neber)重排法、Michael自由基加成法、(Srecker)法合成DL-草铵膦；化学法合成L-草铵膦：D-缬氨酸甲酯和(S)-2-羟基-3-蒎酮为辅助剂的手性辅助剂诱导法、L-谷氨酸和L-蛋氨酸为手性源的天然氨基酸手性源法、不对称Strecker反应和不对称Michael加成法、利用奎宁进行外消旋体拆分法；酶法合成L-草铵膦主要有蛋白酶水解法、磷酸二酯酶I水解法，酰基转移酶I催化法，谷氨酰胺酶三种酶协同水解法；转氨酶法；α-胰乳蛋白酶拆分法、酰胺酶拆分法、脱乙酰基酶拆分法、D-氨基酸氧化酶拆分法等(现代农药，2009，8(3)：1-5)。目前应用于工业化生产草铵膦的方法可归结为以下三条路线：拜耳公司利用Michael自由基加成法制备D,L-草铵膦；Srecker法合成D,L-草铵膦；明治制果不对称催化加氢合成L-草铵膦。其中Srecker法合成D,L-草铵膦路线反应条件温和，是目前产业化大生产所采用的路线。该路线以亚磷酸三乙酯和三氯化磷为起始原料，经歧化、格氏、甲基化、加成、腈铵化、酸解、铵化反应制得D,L-草铵膦。用腈水解酶选择性催化水解反应替换Srecker路线中的酸解步骤，催化路线中的α-氨基腈底物(2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁腈)制备合成L-草铵膦的重要手性前体：L-2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁酸，为实现工业化路线的Srecker法合成L-草铵膦提供了依据。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株产腈水解酶的菌株--产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)ZJB-16005，及其生物催化α-氨基腈底物(2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁腈)制备L-2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁酸的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一株具有产腈水解酶性能的新菌株--产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)ZJB-16005，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNo：M2017032，保藏日期2017年01月13日，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072。本专利技术还涉及所述的产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)ZJB-16005催化α-氨基腈(2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁腈)制备作为L-草铵膦重要手性前体的L-2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁酸中的应用，所述的应用为：以产酸克雷伯菌ZJB-16005经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁腈为底物，以蒸馏水或100mM、pH7.0磷酸缓冲液为反应介质，在30-50℃、100-200rpm条件下进行转化反应，反应结束，将反应液分离纯化，获得L-2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁酸。腈水解酶生物催化α-氨基腈(2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁腈)生成L-2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁酸过程如下：进一步，所述催化剂用量以湿菌体重量计为10-100g/L反应介质，优选35g/L，所述底物初始加入终浓度为2-100g/L反应介质，优选5g/L。进一步，所述催化剂按如下方法制备：(1)斜面培养：将产酸克雷伯菌ZJB-16005接种至斜面培养基，在30℃培养48h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：甘露醇1～20.0g/L，谷氨酸钠1～10.0g/L，酵母膏1～5.0g/L，K2HPO40.1～1.0g/L，KH2PO40.1～1.0g/L，MgSO40.1～1.0g/L，己内酰胺0.1～2.0g/L，琼脂20.0g/L，溶剂为去离子水，pH7.0-7.5；优选所述斜面培养基终浓度组成为：甘露醇10.0g/L，谷氨酸钠7.0g/L，酵母膏3.0g/L，K2HPO40.75g/L，KH2PO40.75g/L，MgSO40.5g/L，己内酰胺1.0g/L，琼脂20.0g/L，溶剂为去离子水，pH7.0-7.5；(2)种子培养：挑取斜面菌体接种至种子培养基，在30℃培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：甘露醇1～20.0g/L，谷氨酸钠1～10.0g/L，酵母膏1～5.0g/L，K2HPO40.1～1.0g/L，KH2PO40.1～1.0g/L，MgSO40.1～1.0g/L，己内酰胺0.1～2.0g/L，溶剂为去离子水，pH7.0-7.5；优选所述种子培养基终浓度组成为：甘露醇10.0g/L，谷氨酸钠7.0g/L，酵母膏3.0g/L，K2HPO40.75g/L，KH2PO40.75g/L，MgSO40.5g/L，己内酰胺1.0g/L，溶剂为去离子水，pH7.0-7.5；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1～10％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养48h后，在12000g下离心10min，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成为：甘露醇1～20.0g/L，谷氨酸钠1～10.0g/L，酵母膏1～5.0g/L，K2HPO40.1～1.0g/L，K本文档来自技高网...

【技术保护点】
产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)ZJB‑16005，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M 2017032，保藏日期2017年01月13日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

【技术特征摘要】
1.产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)ZJB-16005，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNo：M2017032，保藏日期2017年01月13日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。2.一种权利要求1所述产酸克雷伯菌ZJB-16005在催化α-氨基腈(2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁腈)制备L-2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁酸中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以产酸克雷伯菌ZJB-16005经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁腈为底物，以蒸馏水或100mM、pH7.0磷酸缓冲液为反应介质，在30-50℃、100-200rpm条件下进行转化反应，反应结束，将反应液分离纯化，获得L-2-氨基-4(羟乙基甲基磷酰基)-丁酸。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以湿菌体重量计为20-100g/L反应介质，所述底物初始加入终浓度为2-10g/L反应介质。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：(1)斜面培养：将产酸克雷伯菌ZJB-16005接种至斜面培养基，在30℃培养48h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：甘露醇1～20.0g/L，谷氨酸钠1～10.0g/L，酵母膏1～5.0g/L，K2HPO40.1～1.0g/L，KH2PO40.1～1.0g/L，MgSO40.1～1.0g/L，己内酰胺...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，郑裕国，吕胜芝，徐建妙，柳志强，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33