用于基于AFLP的高通量多态性检测的方法技术

本发明专利技术涉及用于基于AFLP的高通量多态性检测的方法，其用于高通量发现、检测和基因分型一个或多个样品中一个或多个遗传标记的方法，其包括步骤：限制性内切核酸酶消化DNA、接头‑连接、任选的预扩增、选择性扩增、混合集中扩增产物、测序具有足够冗余度的所述文库、聚簇分析，接着鉴定所述文库内和/或文库之间的遗传标记，并确定所述遗传标记的(共)显性的基因分型。本发明专利技术提供方法或策略，其组合AFLP的功效和一般适用性与某些高通量测序技术以建立一般可适用的多态性评分系统。在该策略中，也解决了抽样变异的问题，确保基因分型具有高精确度和最佳化数据集具有最少量的遗漏基因分型的概率。

【技术实现步骤摘要】
用于基于AFLP的高通量多态性检测的方法本申请是申请号为200680051561.8，申请日为2006年12月20日，专利技术名称为“用于基于AFLP的高通量多态性检测的方法”的中国专利申请的分案申请。
本专利技术涉及分子生物学和和遗传学领域。本专利技术涉及快速发现、检测和大规模基因分型核酸样品中或样品之间的多态性。鉴定的多态性可用作遗传标记。
技术介绍
科学的、特别是医学的团体长期期望研究基因组DNA。基因组DNA在鉴定、诊断和治疗疾病比如癌症和阿尔茨海默病中起关键作用。除了疾病鉴定和治疗之外，基因组DNA的研究可在植物和动物繁殖努力中提供重要的优点，其可提供世界上对食品和营养品问题的答案。已知许多疾病与特定的遗传组分、特别地与特定基因中的多态性相关。目前，大样品比如基因组的多态性的鉴定是一项艰巨和耗时的工作。然而，这样的鉴定对领域比如生物医学研究、开发药品、组织分型、基因分型和人口研究有很大的价值。标记，即遗传标记，已被用作遗传分型方法很长时间，即将表型性状同DNA(基因)的特定部分的存在、不存在或量相连接。最多用途的遗传分型技术之一是AFLP，其已经使用了许多年，广泛适用于任何生物体(对于综述，参见Savelkoul等，J.Clin.Microbiol,1999,37(10),3083-3091；Bensch等，MolecularEcology,2005,14,2899-2914)。从AFLP技术在九十年代初期专利技术以来，已经发现AFLP技术(Zabeau&Vos,1993；Vos等人，1995)广泛用于植物育种及其它领域。这应归于AFLP的一些特征，其中最重要的是不需要现有序列信息以可重现的方式产生大量遗传标记。而且，选择性扩增(AFLP的基石)的原理保证了可以使扩增片段的数量符合检测系统的分辨率，与基因组大小或来源无关。AFLP片段的检测通常通过在平板-凝胶上的电泳(Vos等人，1995)或毛细管电泳(vanderMeulen等人，2002)进行。以这种方式评分的大多数AFLP标记表示(单一核苷酸)存在于用于AFLP模板制备的限制性内切酶识别位点或选择性AFLP引物覆盖的其旁侧核苷酸(flankingnucleotides)的多态性。其余的AFLP标记为在限制性片段的内部序列中出现的插入/缺失多态性和在小的限制性片段(<约100bp)中出现的单核苷酸取代的非常小的部分，对于这些片段，其可引起在两个等位基因之间可重现的迁移率变化；这些AFLP标记能被共显性地(co-dominantly)评分而不用必须依赖于带的强度。因此，在典型的AFLP指纹图谱中，所述AFLP标记占扩增片段的小部分(小于50百分比，但通常小于20百分比)，而其余的通常被称为恒定的AFLP片段。然而，后者在凝胶评分过程中有用，因为它们起用于计算AFLP标记的片段迁移率和辅助定量用于共显性评分的标记的定位点的作用。目前，AFLP标记的共显性评分(纯合性或杂合性评分)只限于采集分离种群指纹的范围中。在没有联系的系的小组中，仅仅显性评分是可能的。尽管由于在扩增和检测步骤中高倍增水平引起AFLP的通量非常高，速率限定步骤是电泳的分辨力。基于限制性内切酶组合(EC)、引物组合(PC)和迁移率，电泳允许独特鉴定大多数扩增片段，但理想地，所述检测系统应当能够测定扩增片段的全部序列以获得所有的多态性。通过测序代替迁移率测定的检测将增加通量，因为：1)将在大多数(或所有的)扩增片段中检测到位于内部序列的多态性；这将相当大地增加每个PC标记的数量。2)由于AFLP标记和恒定的条带的共迁移不会引起AFLP标记损失。3)共显性评分不依赖于定量带强度，且与个体指纹图谱的亲缘关系无关。迄今为止，通过测序检测AFLP标记/序列还不是经济可行的，因为，包括其它的限制，Sanger双脱氧法测序技术及其它常规测序技术的费用限制。因此，本专利技术的一个目标是提供基于测序来检测AFLP标记物或其它的遗传标记比如SNP标记的经济可行的方法。与经由用于基因分型(即诊断)目的的测序来检测许多包含AFLP或SNP的片段进一步相关的重要问题是抽样变异问题。特别地，这指当分析许多片段和没有观察到特定片段时，人们不得不确定这不是由于没有在检测步骤中抽样涉及的片段，尽管它们存在于所述片段混合物中，因为这将引起标记的假阴性评分。该限制不能应用到电泳检测，因为在凝胶上位置信息是有用的。因此，本专利技术的进一步的目标之一是提供解决抽样变异问题或至少减少由抽样变异引起的误差至可接受的最少值的方法。
技术实现思路
本专利技术人已经发现在用于高通量测序的某些调整的步骤中借助于AFLP的测序可以检测AFLP和SNP标记。因此，本专利技术提供方法或策略，其组合AFLP的功效和一般适用性与某些高通量测序技术以建立一般可适用的多态性评分系统。在该策略中，也解决了抽样变异的问题，确保基因分型具有高精确度和最佳化数据集具有最少量的遗漏基因分型的概率。定义在下述说明书和实施例中，使用了许多术语。为了提供对包括这类术语给出的范围的说明书和权利要求书清楚一致的理解，提供下述定义，除非本文另有定义，使用的所有技术和科学术语具有如本专利技术所属领域技术人员通常理解的相同的含义。将所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献公开的内容以其全部引入本文作为参考。多态性：多态性指在种群中存在核苷酸序列的两种或多种变体。多态性可包括一个或多个碱基变化、插入、重复或缺失。多态性包括例如单一序列重复(SSR)和单一核苷酸多态性(SNP)，其为当单一核苷酸：腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)被改变时出现的变异。变异通常必须出现在至少1％的种群中才被认为SNP。SNP构成例如90％的所有人类遗传变异，且沿着人类基因组的每100至300个碱基出现。每三个SNP中两个用胸腺嘧啶(T)取代了胞嘧啶(C)。在例如人类或植物的DNA序列中的变异可以影响它们怎样处理疾病、细菌、病毒、化学品、药物等。核酸：根据本专利技术的核酸可包括任何嘧啶和嘌呤碱基的聚合物或低聚物，所述碱基分别优选胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，和腺嘌呤及鸟嘌呤(参见，AlbertL.Lehninger,PrinciplesofBiochemistry,at793-800(WorthPub.1982)，将其全部内容引入本文作为参考用于所有目的)。本专利技术考虑了脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核苷酸组分，和其任何化学变体，比如这些碱基的甲基化的、羟甲基化的或糖基化的形式等。所述聚合物或低聚物在组成上可以是异源的或同源的，且可以是从天然存在的来源分离的或可以是人工或合成产生的。而且，所述核酸可以是DNA或RNA或其混合物，且其可以以单链或双链形式永久或瞬间存在，所述双链形式包括同源双链、异源双链和杂交体状态。复杂性降低：术语复杂性降低用于表示其中核酸样品比如基因组DNA的复杂性通过产生样品亚型而降低。该亚型可以是整体(即复合物)样品的代表，且优选可重现的亚型。可重现的在本文中指当使用相同方法降低相同样品的复杂性时，获得相同的或至少可比较的亚型。用于复杂性降低的方法可以是本领域已知的用于复杂性降低的任何方法。用于复杂性降低的方法的优选的实例包括例如(KeygeneN.V.，荷兰；参见例如本文档来自技高网...

【技术保护点】
高通量发现、检测和基因分型多个样品中一种或多种遗传标记的方法，包括下述步骤：a)提供来自多种样品的DNA；b)用至少一种限制性内切酶限制DNA以产生限制性片段；c)连接接头与限制性片段，产生接头‑连接的限制性片段；d)用引物对扩增接头‑连接的限制性片段，其中所述引物中的至少一个和至少部分接头互补，从而针对每个样品产生标记的扩增的接头连接的限制性片段的文库；e)使用高通量测序技术测序该文库，并选择被测序至少6倍的扩增的接头‑连接的限制性片段；f)使用标识符标记鉴定文库内和/或文库之间的遗传标记；g)测定文库中遗传标记的共显性基因型，其中所述方法不用于人和动物疾病的诊断。

【技术特征摘要】
2005.12.22 US 60/752,5901.高通量发现、检测和基因分型多个样品中一种或多种遗传标记的方法，包括下述步骤：a)提供来自多种样品的DNA；b)用至少一种限制性内切酶限制DNA以产生限制性片段；c)连接接头与限制性片段，产生接头-连接的限制性片段；d)用引物对扩增接头-连接的限制性片段，其中所述引物中的至少一个和至少部分接头互补，从而针对每个样品产生标记的扩增的接头连接的限制性片段的文库；e)使用高通量测序技术测序该文库，并选择被测序至少6倍的扩增的接头-连接的限制性片段；f)使用标识符标记鉴定文库内和/或文库之间的遗传标记；g)测定文库中遗传标记的共显性基因型，其中所述方法不用于人和动物疾病的诊断。2.根据权利要求1所述的方法，其中遗传标记为AFLP标记或SNP标记。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中测序基于合成的测序。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中测序基于焦磷酸测序。5.根据权利要求1所述的方法，其中测序在固体载体上进行的。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述固体载体是珠粒。7.根据权利要求1所述的方法，其中测序包括下述步骤：-退火扩增的接头-连接的限制性片段至珠粒，每个珠粒同单个接头-连接的片段退火；-在油包水型微型反应器中乳化珠粒；每个油包水型微型反应器包括单个珠粒；-进行乳剂PCR以在珠粒表面上扩增接头-连接的限制性片段；-将珠粒装填在池中，每个池包括单个珠粒；和-产生焦磷酸盐信号。8.根据权利要求1所述的方法，其中标记的扩增的接头-连接的限制性片段的平均冗余度为至少6。9.根据权利要求1所述的方法，其中标记的扩增的接头-连接的限制性片段的平均冗余度为至少7。10.根据权利要求1所述的方法，其中标记的扩增的接头-连接的限制性片段的平均冗余度为至少8。11.根据权利要求1所述的方法，其中标记的扩增的接头-连接的限制性片段的平均冗余度为至少9。12.根据权利要求1所述的方法，其中测定每个接头-连接的限制性片段的序列至少6倍。13.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·J·T·范艾克，A·P·索伦森，M·G·M·范施里克，
申请(专利权)人：凯津公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL