一种牛源肌酸激酶同工酶双抗体夹心ELISA快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种牛源肌酸激酶同工酶(CK‑BB)双抗体夹心ELISA快速检测试剂盒以及对牛源肌酸激酶同工酶(CK‑BB)检测方法。本发明专利技术具有定量、检测浓度范围大、灵敏度高、特异性强、重复性好、检测所需时间短等优点，建立奶牛子宫内膜炎早期快速诊断新方法，实现进行奶牛子宫内膜炎快速检测和辅助临床检查做出诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种牛源肌酸激酶同工酶双抗体夹心ELISA快速检测试剂盒
本专利技术涉及胶体金免疫层析快速检测领域，具体涉及一种牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)双抗体夹心ELISA快速检测试剂盒及方法。
技术介绍
近年来我国奶牛业发展十分迅速，然而不孕症对奶牛养殖业的发展有着重要的影响。大量资料表明，不孕症占奶牛疾病的20％～30％，子宫内膜炎占不孕症的40％～60％。引起奶牛子宫内膜炎的病因较多，但主要原因是产后的早期感染所致，有研究表明奶牛产后的早期阶段有93％的牛发生子宫感染细菌，到46-60天时感染率降低到39％。奶牛子宫内膜炎使受精卵不能着床或胚胎早期死亡，延迟了产犊间隔，严重影响奶牛的繁殖和生产能力及效率，给奶牛生产造成极大的经济损失。据资料报道，美国每年有12.19％的奶牛由于不孕症或繁殖疾病而被淘汰，占淘汰母牛的52.37％，每年因不孕症损失高达2.7亿美元；北京农业大学对北京、南京、上海等16个城市调查，子宫内膜炎占不孕奶牛的68.34％，国内每年淘汰的不孕奶牛占淘汰总数的60％-70％。肌酸激酶(CreatineKinase,CK；EC2.7.3.2)分子量81000～82000Da，是由两个亚基(M和B)组成的二聚体，可逆催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，在肌酸和磷酸肌酸的转化反应中起着重要的作用。比如在能量代谢最旺盛的肌肉组织和脑组织中，CK的活性是最高的。在内脏器官中，子宫是CK第三活跃的器官，头两位是骨骼肌和心肌。根据其同工酶亚基和分布位置的不同，在牛中存在有三种CK同功酶，其中：CK-MM(特异存在于骨骼肌)、CK-MB(特异存在于心肌)和CK-BB(从牛脑中获得)。以上这些同功酶都存在于细胞质中，Galitzer和Oehme(1985)对牛所有器官的CK进行检测发现，内脏器官中含有的CK要远远少于骨骼肌和心肌，并且大部分的CK属于同功酶CK-BB。健康牛血清中的CK组成几乎全部由CK-MM构成，但研究发现在怀孕中和产后妇女、怀孕豚鼠的血清中还存在有可检测到的CK-BB(脑源或平滑肌源)和CK-MB(Clarketal.,1994)。造成以上现象的原因很有可能是在怀孕后期对能量(新陈代谢)更高的需求(Clarketal.,1994)，即子宫组织在分娩前后对其机械性和新陈代谢有更高的要求(Abramovetal.,1996)。我们研究表明子宫内膜感染发炎后血清肌酸激酶活性显著增高，据研究结果其可作为奶牛子宫内膜炎的重要诊断指标。目前，奶牛子宫内膜炎的诊断主要依靠视诊、触诊和子宫探针为主的传统方法，存在早期诊断确诊率低和导致植入性病原菌二次感染的问题。因此，迫切需要研究建立一种适用于奶牛子宫内膜炎早期排查的快速、灵敏、经济适用、操作简便的现场快速检测方法。
技术实现思路
本研究根据奶牛子宫内膜炎与血清肌酸激酶活性的正相关性，通过重组表达牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)，制备筛选鼠源单克隆抗体，进一步利用双抗体夹心ELISA法研制了一种快速检测牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)的双抗体夹心ELISA试剂盒，用于田间监测产后奶牛肌酸激酶同工酶(CK-BB)的变化。本专利技术的目的是提供一种牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)的双抗体夹心ELISA试剂盒及方法，由此快速即时检测子宫内膜炎，通过双抗体夹心ELISA试剂盒定量检测的方法，检测牛血清中肌酸激酶同工酶(CK-BB)的浓度，从而用于评估奶牛子宫内膜炎情况，准确，快速，灵敏度高，无需专业人员操作，成本较低，便于推广使用。为达到上述目的，本专利技术采用第一技术方案：一种牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)的双抗体夹心ELISA试剂盒，包括：包被捕获抗体的酶标板，封闭液，洗涤液，底物显色液，终止液以及检测抗体。所述捕获抗体是鼠抗CK-BB单抗。所述检测抗体是HRP标记的鼠抗CK-BB单抗。利用所述牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)的双抗体夹心ELISA试剂盒检测牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)的方法，其步骤如下：(1)用CB将CK-BB单抗稀释至5ug/ml，每孔100ul，4℃包被过夜；(2)洗板3-5次，拍干，标品/样本100ul，25℃反应45min；(3)洗板3-5次，拍干，加入酶标抗体，25℃避光反应30min；(4)洗板3-5次，拍干，加入显色剂，25℃避光反应15min；加终止液后测值OD450(5)标准方程的建立：使用酶标仪测定已知浓度的牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)，得到对应的OD405-CK-BB浓度对数值，拟合得出线性标准线性方程；(6)待测样品的测定：将测得的OD405值作为x值代入方程，计算出的y值，y值为CK-BB浓度(ng/ml)的对数值，进而计算出待测样品中CK-BB的浓度。与现有技术相比，本专利技术的有益效果至少在于：试剂盒中，作为检测标记物CK-BB的单克隆抗体，标记条件成熟稳定无毒，试剂盒本身分辨率、灵敏度、稳定较强，可做定量检测。本专利技术的CK-BB双抗体夹心ELISA快速检测试剂盒及检测系统，操作简单直接加血清样本、检测时间短，适合于推广使用，克服了现有化学发光法，价格昂贵，检测耗时且需要投入专业操作人员的缺点，能独立处理数据从而定量检测的优点，特别适合牛血清CK-BB水平在基层牧场的检测。本专利技术通过临床验证、评价和对本方法的完善，提高检测血清肌酸激酶指标揭示和反应奶牛子宫内膜感染炎症程度的灵敏性、准确性，最终建立奶牛子宫内膜炎早期快速诊断新方法，做到不需要专业仪器，通过简单操作，实现在田间进行奶牛子宫内膜炎现场快速检测和辅助临床检查做出早期快速诊断。附图说明下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步描述：图1以牛心源肌酸激酶(CK-MB)为标准物采用SDS-PAGE电泳，检测子宫内膜炎牛血清样本，图中的CK标准物为商品牛源CK-MB和兔源CK；图2样本牛血清与CK-BB多克隆抗体WB检测，图2-A为正常曝光时间拍得WB照片，图2-B为长时间曝拍得WB照片；图2-C表明所有样本血清中的均与抗CK-BB多克隆抗体有特异性反应；图3质粒pET28b-CK-BB经NdeI和XhoI双酶切；图4牛肌酸激酶同功酶CK-BB蛋白诱导结果：1：诱导前总蛋白，2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀；图5牛肌酸激酶同功酶CK-BB蛋白蛋白纯化SDS-PAGE分析图，M：Proteinmarker；1：上样；2：流出；3：10mMImidazole洗脱组分；4：20mMImidazole洗脱组分；5-9：50mMImidazole洗脱组分；10-12：500mMImidazole洗脱组分；图6为牛肌酸激酶同功酶CK-BB蛋白蛋白SDS-PAGE分析图，M：Proteinmarker；1：目的蛋白；图7牛肌酸激酶同功酶CK-BB蛋白WesternBlot分析图M：Proteinmarker；1：目的蛋白；图8试剂盒Elisa条件优化标准曲线图；图9Elisa线性标准线性方程。具体实施方式实施例1.奶牛血清中肌酸激酶与子宫内膜炎的相关性研究取得通过常规方法确诊为患有子宫内膜炎牛的血清，检测其肌酸激酶(CK)值，通过对照与阳性组的比较，确定牛子宫内膜炎与CK的相关性。采集到来自呼和浩特和包头周边牛场的多份临床症状为奶牛子宫内膜炎本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛源肌酸激酶同工酶(CK‑BB)的双抗体夹心ELISA试剂盒，包括：包被捕获抗体的酶标板，封闭液，洗涤液，底物显色液，终止液以及检测抗体。

【技术特征摘要】
1.一种牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)的双抗体夹心ELISA试剂盒，包括：包被捕获抗体的酶标板，封闭液，洗涤液，底物显色液，终止液以及检测抗体。2.根据权利要求1中所述的牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体是鼠抗CK-BB单抗，所述检测抗体是检测抗体是HRP标记的鼠抗CK-BB单抗。3.一种牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)的双抗体夹心ELISA试剂盒检测牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)的方法，其步骤如下：(1)用CB将CK-BB单抗稀释至5ug/ml，每孔100ul，4℃包被过夜；(2)洗板3-5次，拍干，标品/样本100ul，25℃反...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵世华，杨鼎，达来宝力格，刘威，王根云，兰儒冰，高娃，杨斌，张月梅，宋越，张帆，戴伶俐，陈伟，宋爱军，
申请(专利权)人：内蒙古自治区农牧业科学院，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15