一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14‑3‑3ζ基因片段的克隆与应用制造技术

本发明专利技术属于动物分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14‑3‑3ζ基因片段的克隆与应用。14‑3‑3ζ基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，其长度为2050bp，在第938bp处为T938C的碱基突变，导致

【技术实现步骤摘要】
一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段的克隆与应用
本专利技术属于动物分子标记制备
，具体涉及一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段的克隆与应用。
技术介绍
猪肉是肉类消费的重要组成部分，是人类获得蛋白质营养物质的主要途径之一，在国人饮食结构中占据绝对的比重。长期以来，以提高生长速度、减少饲料消耗、增加瘦肉率为主要目标传统猪育种方法取得了显著成绩。但在猪的瘦肉率和生长速度大幅度提高的同时，传统的育种手段也遭遇到发展的瓶颈，已经很难像过去那样大幅度地提高猪的生产水平了。而猪生产水平的提高实际上降低了猪的体质和适应性，并影响到猪的肌肉品质。随着我国社会经济的发展，人民生活水平与消费水平的提高，人们在膳食结构与饮食观念也发生了变化，对猪肉品质的要求也越来越高。这一系列的矛盾和问题，迫切需要用新的手段和对策解决如何培育出安全环保优质新品种猪的问题。快速发展的遗传学和分子生物学技术为突破传统育种的瓶颈提供强有力的补充，将猪育种工作推向新的分子育种阶段。目前，标记辅助选择(MAS)、重要数量性状的基因组区域定位、候选基因法和全基因组关联分析等研究已经成功地应用到国内外的猪育种实践当中，取得了巨大的经济效益和社会效益。已有多个位于功能基因内部的与生产性状紧密连锁的分子标记被发现。例如，与生长性状显著相关的MC4R、IGF-1、GRF，与产仔数和排卵率显著相关的候选基因ESR、FSH、PRLR、RBP4，与胴体性状显著相关的MSTN、HSL，与肉质性状显著相关的PRKAG3、Hal、OB、RYR1、H-FABP，与抗病能力显著相关的FUT1、SLA、NRAMP、大肠杆菌k88受体基因，以及与被毛颜色显著相关的KIT、MC1R。这些基因标记信息与传统的表型信息一起，通过标记辅助选择的方法，被积极的应用在生猪的商业生产中，给生猪产品的提高与促进带来了很大的帮助。14-3-3蛋白又称酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白(tyrosine3-monooxygenase/tryptophan5-monooxygenaseactivationprotein)，是一个高度保守的、在真核生物中广泛表达的、具有复杂功能的调节性蛋白家族，主要通过与Ser/Thr磷酸化蛋白绑定结合发挥作用，参与许多重要的细胞生理过程，如信号转导、酶和细胞因子活性调节、细胞骨架动力学调节、细胞周期调控、细胞增生、分化和凋亡调节等。哺乳动物14-3-3蛋白至少存在7个由不同基因编码的高度保守的亚型，分别为β、γ、ε、ε、σ、ζ和τ，而β和σ分别是b和x的磷酸化形式，各亚型都有特殊的功能。通常14-3-3蛋白主要以同源或异源二聚体存在，14-3-3蛋白的N-末端约26-个氨基酸残基组成的结构域可能在14-3-3蛋白的二聚化中发挥了重要作用。14-3-3ζ是14-3-3蛋白家族的重要一员，在肌形成及骨骼肌的生长发育中也起着非常重要的作用。MEF2(myocyteenhancerfactor-2)是肌肉中一个重要的转录因子，其介导的多个信号通路在肌肉发育过程中起着关键的调节作用，它主要通过激活肌肉中一些特异表达的基因来发挥功能，但其活性又受到II型HDACs(histonedeacetylases)和MITR(MEF2-interactingtranscriptionrepressor)的调控，HDACs和MITR能够在细胞核中与MEF2结合从而抑制MEF2的活性，而14-3-3ζ蛋白在细胞核中能够结合II型HDACs和MITR，使HDACs和MITR与MEF2解离而游离出细胞核，从而间接地激活MEF2。鉴于14-3-3ζ基因对动物骨骼肌发育的调控作用，我们认为它很可能在猪的肌肉沉积过程中起到重要作用，进而影响猪的重要经济性状－胴体性状。但目前国内外对猪14-3-3ζ基因的cDNA全长克隆、基因组结构分析以及多态性研究还是空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克隆一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段，寻找突变位点，并建立相应的检测方法，分析其对猪胴体性状的关系，为猪的分子标记辅助选择提供一种新的分子标记。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段，所述14-3-3ζ基因片段的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示。进一步地，所述序列表SEQIDNO:3的长度为2050bp，在序列表SEQIDNO:2第938bp处为T938C的碱基突变，导致BstxIPCR-RFLP多态性。本专利技术设计了一对用于检测上述T938C碱基突变的引物对(该引物也是克隆本专利技术猪14-3-3ζ基因片段核苷酸序列的引物对)，其DNA序列如下所示：正向引物：5'TGCCTGATAATTGGTAT3'；反向引物：5'TTAGCGTGCTGTCTTTGT3'。本专利技术提供了一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段的克隆方法，包括以下步骤：步骤1：用人14-3-3ζ基因cDNA为探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签；然后拼接猪EST-重叠群，根据EST-重叠群序列设计基因特异性外侧引物GSP-5、GSP-3和CDS区引物CDS-F、CDS-R，其DNA序列如下所示：GSP-5：5’AGACGACCCTCCAAGATGACCTACGG3’，GSP-3：5’TGTCTGATGATGCCCTGCTTCCTTTGC3’，CDS-F：5’CCCAGAGACTGCTGAACCC3’，CDS-R：5’GTGGGACAGCATGGATGACA3’；以成年梅山猪肌肉组织中提取总RNA为模板，进行扩增、产物纯化和克隆测序，通过序列拼接获得如序列表SEQIDNO:1所示的猪14-3-3ζ基因片段的cDNA序列；步骤2：在步骤1的cDNA序列的第5至第7个内含子上设计引物，其DNA序列如下所示：I5F：5’TGCCTGATAATTGGTAT3’，I7R：5’TTAGCGTGCTGTCTTTGT3’；以大白猪和梅山猪基因组DNA作为模版，进行扩增和克隆测序，获得如序列表SEQIDNO:3所述的猪14-3-3ζ基因片段的核苷酸序列，其中第938bp处为T938C的碱基突变。本专利技术还提供了一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段在猪胴体性状分子标记辅助选择中的应用。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术发现了一个与猪胴体性状相关的猪14-3-3ζ基因片段，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。附图说明图1为本专利技术的技术流程图。图2为本专利技术中用于BstxIPCR-RFLP分型所用的猪14-3-3ζ基因片段的DNA序列片段，下划线为引物。图3为本专利技术克隆的猪14-3-3ζ基因片段第6外显子的Bstx1PCR-RFLP的两种基因型电泳结果，其中M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限定本专利技术的保护范围。若为特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例一猪14-3-3ζ基因片段的核苷酸序列克隆1.1猪14-3-3ζ基因片段的cDNA克隆1.1.1引物设计利用报道本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的

【技术特征摘要】
1.一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段，其特征在于，所述14-3-3ζ基因片段的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示。2.根据权利要求1所述的一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段，其特征在于，所述序列表SEQIDNO:3的长度为2050bp，在序列表SEQIDNO:2第938bp处为T938C的碱基突变，导致BstxIPCR-RFLP多态性。3.检测权利要求2所述碱基突变的引物对，其特征在于，所述引物对的DNA序列如下所示：正向引物：5'TGCCTGATAATTGGTAT3'；反向引物：5'TTAGCGTGCTGTCTTTGT3'。4.一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：用人14-3-3ζ基因cDNA为探针，作同源序列筛选，获得同源性90%以上的表达序列标签；然后拼接猪EST-重叠群，根据EST-重叠群序列设计基因特异性外侧引物GSP-5、GSP-3和CDS区引物CDS-F、CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐永杰，张朋朋，徐海霞，李瑞，张凯丽，王素莹，吴伟，
申请(专利权)人：信阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41