一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记及其应用，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。(1)本发明专利技术所述分子标记能够针对幼苗期的草莓，准确检测幼苗炭疽病菌的感染情况；(2)本发明专利技术所述分子标记具有检测时间短、检测成本低和高通量的优点；(3)本发明专利技术所述分子标记特异性好、灵敏度高、结果重现性好。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测致病菌的方法，具体为一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记及其应用。
技术介绍
草莓炭疽病由真菌半知菌亚门毛盘孢属草莓炭疽菌侵染所致，草莓炭疽病的有性阶段为子囊菌亚门小丛壳属。病菌以分生孢子在发病组织或落地病残体中越冬，同时，在田间能够分生孢子借助雨水及带菌的操作工具、病叶、病果等进行传播。草莓炭疽菌的侵染最适条件为：气温为28～32℃，相对湿度在90％以上，是典型的高温高湿型病菌。5月下旬后，当气温上升到25℃以上，草莓匍匐茎或近地面的幼嫩组织易受病菌侵染；7～9月间在高温高湿条件下，病菌传播蔓延迅速，特别是连续阴雨或阵雨2～5天或台风过后的草莓连作田、老残叶多、氮肥过量、植株幼嫩及通风透光差的苗地发病严重，可在短时间内造成草莓毁灭性的损失。近几年来，该病的发生有上升趋势，尤其是在草莓连作地，给培育壮苗带来了严重障碍。现有草莓炭疽病的防治方法均是采用药剂进行喷洒，如嘧菌酯和嘧酰胺等。这种治疗方式不仅效果较差；同时多频次、多剂量施用后易造成草莓炭疽病菌产生较高程度的耐药性，从而导致草莓炭疽病的防治失败。因此，草莓炭疽病的防治还需尽早在幼苗期发现，避免其传播为主。
技术实现思路
本专利技术的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够准确检测幼苗期草莓炭疽病的方法，有效防治草莓炭疽病的传播和蔓延，降低草莓耐药性，本专利技术提供了一种一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记及其应用。技术方案：一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQIDNO.1～2；P2，SEQIDNO.3～4；P3，SEQIDNO.5～6。优选的，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰。表1分子标记序列所述的分子标记在制备检测草莓炭疽病菌试剂盒中的应用。优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。优选的，所述试剂盒检测草莓炭疽病菌的步骤包括：(1)取样：提取草莓叶片样品的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200～500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20～50倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。优选的，所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。优选的，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP2μL、LATaq2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。优选的，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。优选的，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。优选的，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。有益效果：(1)本专利技术所述分子标记能够针对幼苗期的草莓，准确检测幼苗炭疽病菌的感染情况；(2)本专利技术所述分子标记具有检测时间短、检测成本低和高通量的优点；(3)本专利技术所述分子标记特异性好、灵敏度高、结果重现性好。附图说明图1是实施例1～3检测结果图；其中，M为分子量为2000bp的Maker；1为实施例1PCR产物电泳结果；2为实施例2PCR产物电泳结果；3为实施例3PCR产物电泳结果。具体实施方式实施例1一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQIDNO.1～2；P2，SEQIDNO.3～4；P3，SEQIDNO.5～6。所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰。所述的分子标记在制备检测草莓炭疽病菌试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。所述试剂盒检测草莓炭疽病菌的步骤包括：(1)取样：提取草莓叶片样品的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP2μL、LATaq2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。实施例2一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQIDNO.1～2；P2，SEQIDNO.3～4；P3，SEQIDNO.5～6。所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰。所述的分子标记在制备检测草莓炭疽病菌试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。所述试剂盒检测草莓炭疽病菌的步骤包括：(1)取样：提取草莓叶片样品的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释300倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释30倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP2μL、LATaq2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。实施例3一种用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记，其特征在于，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记，其特征在于，所述分子标记及其序列为：P1，SEQIDNO.1～2；P2，SEQIDNO.3～4；P3，SEQIDNO.5～6。2.根据权利要求1所述的一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记，其特征在于，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰。3.权利要求1或2所述的分子标记在制备检测草莓炭疽病菌试剂盒中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒检测草莓炭疽病菌的步骤包括：(1)取样：提取草莓叶片样品的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200～500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20～50倍后作为第三轮PCR的模板...

【专利技术属性】
技术研发人员：金仲恩，陈晋纳，欧阳智琨，喻国贞，张帆，全春兰，
申请(专利权)人：苏州蔻美新材料有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32