本发明专利技术公开了一种用于检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的分子标记及其应用，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。(1)本发明专利技术所述分子标记特异性好、检测灵敏度高、稳定性良好；(2)本发明专利技术所述分子标记检测结果重复性良好；(3)本发明专利技术所述试剂盒易于保存，且保存期限延长至8～15个月。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的分子标记及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测微生物耐药基因的方法，具体为一种用于检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的分子标记及其应用。
技术介绍
氨基糖苷类药物主要通过抑制细菌蛋白质的合成而产生抑菌作用。作为一类广谱抗生素，在临床上主要应用于治疗肠道细菌感染，尤其是链霉素、卡那霉素、庆大霉素常用于治疗革兰氏阴性细菌如：沙门氏菌、志贺氏菌、肺炎球菌等引起的感染。但是随着应用的增多，这些细菌对这类药物也产生了广泛的耐药性。猪场分离的细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药率非常高，猪场若长期持续存在抗生素的选择性压力，耐药率可高达97％。国内外耐药性检测试剂盒的研究刚刚起步，并且主要是集中在对人类危害严重的几种病原生物(肿瘤病毒、乙肝病毒、结核分枝杆菌)耐药性的研究上，我国已经有相应的耐药性检测试剂盒的研究和应用。但是这些试剂盒的核心技术都不是多种PCR检测，而是以应用核酸杂交和基因芯片为主要技术。如：乙型肝炎病毒核酸及拉米夫定耐药检测试剂盒、结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒、G+细菌菌种鉴定与耐药检测芯片试剂盒等。同时，国内外已经有较多的利用多重PCR技术检测病原微生物的研究和相应试剂盒的研究报道，如：人乳头瘤病毒的诊断与分型多重PCR试剂盒，脑膜炎病原体多重PCR检测试剂盒、禽流感病毒多重PCR快速检测试剂盒、马铃薯病毒分型检测试剂盒、烟草花叶病毒分型检测试剂盒等。但是目前还没有细菌耐药性PCR检测试剂盒的产品报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种检测灵敏度高、稳定性良好、易保存的检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的产品，本专利技术公开了一种用于检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的分子标记及其应用。技术方案：一种用于检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQIDNO.1～2；P2，SEQIDNO.3～4；P3，SEQIDNO.5～6。优选的，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。表1分子标记序列名称序列(5’-3’)SEQIDNO.P1-FNH2-T(10)CTGACCTTGCGATGCTCTATGA1P1-RCGACTGCCTGGCGTGTTT2P2-FNH2-T(10)ACCCTACGAGGAGACTCTGACTG3P2-RCCAAGCATCGGCATCTCATA4P3-FNH2-T(10)GTCTGGCTATCTTGCTGACA5P3-RGGTGACGGGCTGATACTGG6所述分子标记在制备检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因试剂盒中的应用。优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。优选的，所述试剂盒检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的肺炎球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入20～60μL60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50～300倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。优选的，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP2μL、LATaq2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。优选的，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。优选的，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。优选的，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。有益效果：(1)本专利技术所述分子标记特异性好、检测灵敏度高、稳定性良好；(2)本专利技术所述分子标记检测结果重复性良好；(3)本专利技术所述试剂盒易于保存，且保存期限延长至8～15个月。附图说明图1是实施例1～3检测结果图；其中，1为分子量为1500bp的Maker；3为实施例1PCR产物电泳结果；4为实施例2PCR产物电泳结果；5为实施例3PCR产物电泳结果。具体实施方式实施例1一种用于检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQIDNO.1～2；P2，SEQIDNO.3～4；P3，SEQIDNO.5～6。所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。所述分子标记在制备检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。所述试剂盒检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的肺炎球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入20μL60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP2μL、LATaq2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。实施例2一种用于检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQIDNO.1～2；P2，SEQIDNO.3～4；P3，SEQIDNO.5～6。所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。所述分子标记在制备检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。所述试剂盒检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的肺炎球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入40μL60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的分子标记，其特征在于，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的分子标记，其特征在于，所述分子标记及其序列为：P1，SEQIDNO.1～2；P2，SEQIDNO.3～4；P3，SEQIDNO.5～6。2.根据权利要求1所述的一种用于检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的分子标记，其特征在于，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。3.权利要求1或2所述分子标记在制备检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因试剂盒中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒检测肺炎球菌氨基糖苷类药物耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的肺炎球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入20～60μL60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕少波，李苏杨，李卓才，
申请(专利权)人：苏州乔纳森新材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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