用于棉花中基因功能性分析的病毒诱导的基因沉默(VIGS)制造技术

本发明专利技术涉及采用病毒诱导的基因沉默(VIGS)方法对棉花基因进行功能性分析。更具体地，本发明专利技术借助于烟草脆裂病毒(TRV)载体RNA1和RNA2在棉花中诱导基因沉默，并可分析对棉花植物表型的影响。此外，本发明专利技术还提供瞬时表达载体TRV RNA2，以便在强亚基因组启动子的影响下在棉花植物和植物组织中瞬时表达基因。

【技术实现步骤摘要】
用于棉花中基因功能性分析的病毒诱导的基因沉默(VIGS)本专利技术是申请日为2010年6月10日，申请号为201080035446.8，标题为“用于棉花中基因功能性分析的病毒诱导的基因沉默(VIGS)”的专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2009年6月10日提交的美国临时专利申请61/185,631的权益，在此通过引用将其并入本申请。序列表提交本申请与电子形式的序列表一起提交。序列表名称为2577_195PCT_Sequence_Listing.txt，于2010年6月3日创建。在此通过引用将电子形式序列表中的信息并入本申请。
技术介绍
本专利技术涉及在基因组规模上功能性分析棉花基因的领域。更具体地，本专利技术涉及使用病毒诱导的基因沉默(VIGS)在基因组规模上高通量功能性分析棉花基因的方法。本专利技术还涉及用于在棉花植物中瞬时表达基因的瞬时表达载体和用于在棉花植物中瞬时表达基因的方法。本文所用的出版物和其它材料是用于说明本专利技术的背景，或提供与实践有关的额外细节，它们在此援引加入且分别列在参考书目中供参考。棉花(棉属(Gossypiumspp.))是世界上最重要的纤维植物和重要的油料作物，其生长在超过80个国家中，在2006/2007生长季节世界产量的记录是122,000,000(480磅/包)(美国农业部海外局)。消费量与产量之间的逆差发生在1994/1995年，预期在2009/2010生长季节将持续增加至2,500,000(480磅/包)(UnitedStatesDepartmentofAgriculture–ForeignAgriculturalService[USDA–FAS]2009)。棉花生产为约100,000,000名农民带来收入，且约150个国家参与到棉花进口和出口(Leeetal.,2007)。估计世界范围内其经济影响为约$5,000,000,000,000/年。而且，改进食物和饲料用的棉花种子能够显著提高食物挑战型经济中数百万人的营养和生计。棉花也是可再生生物燃料的潜在候选植物。棉花纤维由近乎纯的纤维素组成。与木质素相比，纤维素易于转化为生物燃料。最佳的棉花纤维生产和加工将确保这种天然可再生的产品相比于源自石油的合成不可再生纤维更有竞争力，以确保更加可持续的发展。为了解决上述问题，棉花的许多农艺学性质，如纤维长度和强度、农业产率、耐旱性和抗害虫性需要通过可利用的遗传资源和鉴定基因功能的快速方法来增强(Udalletal.,2006)。棉花是广泛生长且用于生产天然织物纤维和棉花籽油的重要作物。棉花纤维是用于研究细胞伸长以及细胞壁和纤维素生物合成的模型系统。此外，棉花纤维是单细胞，因此细胞伸长可独立于细胞分裂来评价。将棉花纤维用作植物发育的模型系统的最显著优点之一是Beasley和Ting在1973年对棉花胚珠的培养方法进行了优化。棉花属包括约45个二倍体(2n＝2x＝26)和5个四倍体(2n＝4x＝52)的物种，它们全部显示出二体遗传模式。尽管也在一定程度上使用其它三种物种，海岛棉(Gossypiumbarbadense)(四倍体)、亚洲棉(Gossypiumarboretum)(二倍体)和草棉(Gossypiumherbaceum)(二倍体)，但最普遍的棉花变种是陆地棉(Gossypiumhirsutum)(陆地棉，四倍体)的形式，其占世界范围内每年棉花作物的约95％。其它这三类物种也是重要的遗传资源，为专门育种目的提供了基因库。例如，对生物和非生物胁迫具有高抗性的草棉可被用作与陆地棉进行种间杂交以改善其对各种胁迫抗性的良好起始遗传材料。因此，也十分需要在棉属和亲缘植物中进行基因功能性分析的独立于物种的方法。目前，棉花全基因组测序刚刚开始。同时，不断增加的棉属EST序列(目前约400,000个)组和源自在一系列生长条件下由各种组织和器官构建的不同文库的非冗余基因(unigene)组可在网络上以及通过基于这些序列的微阵列分析来获得(Udalletal.,2006)。其它植物基因组序列的可用性起到在棉花EST数据库中鉴定和注解假定的直系同源物的有用平台的作用。虽然可从棉花纤维差异以及叶毛状体和次生木质部细胞形成之间说明相似性，但最终需要在棉花中直接检测假定的直系同源基因的功能。此外，已知棉花纤维表达在其它植物中尚无已知同源物的基因，这些基因赋予了一些独特的纤维性质。即使一些转录因子基因的功能已在拟南芥(Arabidopsis)中测试，但它们的确切功能仍需要在同源棉花植物中进一步确认。鉴定棉属的农艺学和品质性状的重要方法是稳定转化入棉花。然而，稳定转化的棉花植物的低效生产限制了大规模基因鉴定。而且，此过程费力且耗时，不适用于基因组规模上的高通量分析。而且，仅有少量栽培品种可用作转化的宿主。通常，难以通过在棉花中的稳定转化来从良好的起始遗传材料中直接鉴定重要的遗传元件。因此，希望开发出在基因组规模上独立于物种的棉属基因高通量功能性分析的方法。
技术实现思路
在一个实施方式中，本专利技术涉及在棉花(棉属)植物中直接操作靶基因表达的方法。更具体地，本专利技术涉及在全部棉花物种和种质，特别是在四倍体棉花，如陆地棉(Gossypiumhirsutum)和海岛棉(Gossypiumbarbadense)，二倍体棉花，如草棉(Gossypiumherbaceum)和亚洲棉(Gossypiumarboretum)，以及源自种内和种间杂交的种质中调节或抑制一种或多种靶基因表达的方法。所述方法已对属于若干功能性种类的基因，包括参与发育、小RNA途径和次级代谢生物合成的转录因子等进行了测试。特别预期本专利技术的方法和组合物可用于棉花基因的功能性分析中。本专利技术涉及在基因组规模上功能性分析棉花基因的领域。更具体地，本专利技术涉及使用病毒诱导的基因沉默(VIGS)在基因组规模上高通量功能性分析棉花基因的方法。本专利技术还涉及用于在棉花植物和植物组织中瞬时表达基因的瞬时表达载体和用于在棉花植物和植物组织中瞬时表达基因的方法。本专利技术涉及VIGS在可靠且快速和以高通量方式评价棉花(棉属)植物和植物组织基因功能中的应用。一方面，本专利技术提供了用于在棉花(如陆地棉)中进行VIGS的高效和可再生的系统以及方法。在一个实施方式中，本专利技术提供了烟草脆裂病毒(TRV)全病毒基因组的进一步再合成。在另一实施方式中，本专利技术提供了用于全基因组功能性分析的快速沉默方法。在另一实施方式中，本专利技术提供了TRVVIGS系统在克隆和功能性鉴定若干功能性种类基因中的应用。这些重要的基因可用于改进棉花农艺学性状，如抗害虫性。在一个实施方式中，包含TRVRNA2的载体和包含TRVRNA1的载体为合成的植物载体。在另一实施方式中，TRVRNA2包含能够沉默第一目标基因的第一沉默序列。在一个实施方式中，第一沉默序列为目标基因的有义链的序列。在另一实施方式中，第一沉默序列为目标基因的反义链的序列。在另一实施方式中，第一沉默序列为编码能够对第一目标基因进行RNA干扰(RNAi)的短发夹RNA(shRNA)。在另一实施方式中，第一沉默序列为编码能够对第一目标基因进行RNAi的前体微小RNA(miRNA)或miRNA的序列。在另一实施方式中，核酸进一步包含能够沉默第二目标基因的第二沉默本文档来自技高网...

【技术保护点】
在棉花中进行病毒诱导的基因沉默(VIGS)的方法，包括：(a)将包含能够沉默第一目标基因的第一沉默序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV)RNA2序列的载体中，其中所述核酸插入所述TRV RNA2序列以产生包含修饰型TRV RNA2序列的载体，其中所述第一沉默序列选自所述第一目标基因的部分序列、所述第一目标基因的有义链、所述第一目标基因的反义链、shRNA、前体miRNA和miRNA；(b)制备农杆菌的混合培养物，所述混合培养物包含：含有包含修饰型TRV RNA1序列的载体的农杆菌和含有包含所述修饰型TRV RNA2序列的载体的农杆菌，其中所述修饰型TRV RNA1序列是其中插入了内含子的TRV RNA1序列，其中所述插入位于SEQ ID NO:1所示的psTRV1001序列中的10919‑10922的位置内；(c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织以产生受感染的植物组织；和(d)使所述受感染的植物组织生长足够的时间，以在所述受感染的植物中产生系统性TRV感染并由此诱导所述第一目标基因的基因沉默。

【技术特征摘要】
2009.06.10 US 61/185,6311.在棉花中进行病毒诱导的基因沉默(VIGS)的方法，包括：(a)将包含能够沉默第一目标基因的第一沉默序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV)RNA2序列的载体中，其中所述核酸插入所述TRVRNA2序列以产生包含修饰型TRVRNA2序列的载体，其中所述第一沉默序列选自所述第一目标基因的部分序列、所述第一目标基因的有义链、所述第一目标基因的反义链、shRNA、前体miRNA和miRNA；(b)制备农杆菌的混合培养物，所述混合培养物包含：含有包含修饰型TRVRNA1序列的载体的农杆菌和含有包含所述修饰型TRVRNA2序列的载体的农杆菌，其中所述修饰型TRVRNA1序列是其中插入了内含子的TRVRNA1序列，其中所述插入位于SEQIDNO:1所示的psTRV1001序列中的10919-10922的位置内；(c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织以产生受感染的植物组织；和(d)使所述受感染的植物组织生长足够的时间，以在所述受感染的植物中产生系统性TRV感染并由此诱导所述第一目标基因的基因沉默。2.权利要求1的方法，其中所述第一沉默序列为所述第一目标基因的有义链的序列。3.权利要求1的方法，其中所述第一沉默序列为所述第一目标基因的反义链的序列。4.权利要求1的方法，其中所述第一沉默序列编码短发夹RNA(shRNA)或前体微小RNA(miRNA)。5.权利要求1的方法，其中所述核酸进一步包含能够沉默第二目标或候选基因的第二沉默序列，其中所述第二沉默序列选自所述第二目标或候选基因的部分序列、所述第二目标或候选基因的有义链、所述第二目标或候选基因的反义链、shRNA、前体miRNA和miRNA。6.权利要求1的方法，其中所述核酸包含能够沉默多个目标或候选基因的多个沉默序列，其中各沉默序列选自所述目标或候选基因的部分序列、所述目标或候选基因的有义链、所述目标或候选基因的反义链、shRNA、前体miRNA和miRNA。7.权利要求1的方法，其中所述目标基因为候选转录因子基因。8.权利要求1的方法，其中所述目标基因为smRNA生物合成中的候选基因。9.权利要求1的方法，其中所述目标基因选自：(a)原花色素或花色素生物合成途径中的候选基因、(b)棉花纤维发育中的候选基因、(c)叶绿素或类胡萝卜素生物合成途径中的候选基因、和(d)类黄酮生物合成途径中的候选基因。10.权利要求9的方法，其中所述棉花纤维发育中的候选基因为棉花纤维起始、伸长、次生壁沉积、成熟或种子发育中的候选基因。11.权利要求1的方法，其中所述棉花组织为棉花植物、棉花幼苗、棉花胚珠或棉花纤维。12.权利要求1的方法，其中所述棉花为二倍体变种、四倍体变种、种内杂交的变种或种间杂交的变种。13.在棉花中分析基因功能的方法，包括：(a)将包含能够沉默功能待分析的第一候选基因的第一沉默序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV)RNA2序列的载体中，其中所述核酸插入所述TRVRNA2序列以产生包含修饰型TRVRNA2序列的载体，其中所述第一沉默序列选自所述第一候选基因的部分序列、所述第一候选基因的有义链、所述第一候选基因的反义链、shRNA、前体miRNA和miRNA；(b)制备农杆菌的混合培养物，所述混合培养物包含：含有包含修饰型TRVRNA1序列的载体的农杆菌和含有包含所述修饰型TRVRNA2序列的载体的农杆菌，其中所述修饰型TRVRNA1序列是其中插入了内含子的TRVRNA1序列，其中所述插入位于SEQIDNO:1所示的psTRV1001序列中的10919-10922的位置内；(c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织以产生受感染的植物组织；(d)使受感染的植物组织生长足够的时间，以在所述受感染的植物中产生系统TRV感染并由此诱导所述第一候选基因的基因沉默；和(e)分析所述第一沉默的候选基因对所述受感染的植物组织的表型影响。14.权利要求13的方法，其中所述第一沉默序列为所述第一候选基因的有义链的序列。15.权利要求13的方法，其中所述第一沉默序列为所述第一候选基因的反义链的序列。16.权利要求13的方法，其中所述第一沉默序列编码短发夹RNA(shRNA)或前体微小RNA(miRNA)。17.权利要求13的方法，其中所述核酸进一步包含能够沉默第二目标或候选基因的第二沉默序列，其中所述第二沉默序列选自所述第二目标或候选基...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶健，蔡南海，曲景，Y·F·耿，Y·P·步，
申请(专利权)人：淡马锡生命科学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡,SG