用于控制植物有害生物的组合物和方法技术

披露了对鳞翅目有害生物有毒的新颖杀昆虫蛋白。编码这些杀昆虫蛋白的DNA可以用于转化原核和真核生物以表达这些杀昆虫蛋白。这些重组生物或包含这些重组生物或这些杀昆虫蛋白的组合物单独或与适当的农用载体组合可以用于控制不同环境中的鳞翅目有害生物。

【技术实现步骤摘要】
用于控制植物有害生物的组合物和方法专利
本专利技术涉及杀有害生物蛋白和编码它们的核酸分子，连同用于控制植物有害生物的组合物和方法。背景苏云金杆菌(Bt)是一种革兰氏阳性的孢子形成的土壤细菌，其特征在于它产生晶体包含体的能力，该晶体包含体对于某些目以及种的植物有害生物(包括昆虫)是特异地有毒性的，但是对于植物和其他非目标生物是无害的。出于这个原因，包括苏云金杆菌菌株或它们的杀昆虫蛋白质的组合物可以用作环境上可接受的杀昆虫剂以控制农业昆虫有害生物或多种人或动物疾病的昆虫载体。来自苏云金杆菌的晶体(Cry)蛋白主要针对鳞翅目的、双翅目的、以及鞘翅目的有害生物昆虫具有有力的杀昆虫活性。这些蛋白质还已经显示针对以下目的有害生物的活性：膜翅目、同翅目、毛虱目、食毛目、以及壁虱目，连同其他的无脊椎动物目，例如线虫动物门、扁形动物门、以及肉足鞭毛亚门(斐特尔森,J.(Feitelson,J.)1993.在前沿的工程化的杀有害生物剂中的苏云金杆菌家族树(TheBacillusThuringiensisfamilytree.InAdvancedEngineeredPesticides).马塞尔德克尔公司(MarcelDekker,Inc.),纽约,纽约州)。这些蛋白质最初主要基于它们的杀虫活性而被分类为CryI至CryVI。主要的类别是鳞翅目-特异性(I)、鳞翅目-和双翅目-特异性(II)、鞘翅目-特异性(III)、双翅目特异性(IV)、以及线虫特异性(V)和(VI)。这些蛋白质进一步被分类为子族，在各个家族内的更高相关的蛋白质指定了区分的字母，例如CryIA、CryIB、CryIC、等。在各个区分内的甚至更紧密相关的蛋白质被给定名称，例如CryIC(a)、CryIC(b)等。术语“Cry毒素”以及“δ-内毒素”与术语“Cry蛋白”已可互换地使用。对于Cry蛋白和基因的当前新命名法基于氨基酸序列同源性而不是昆虫靶标特异性(克里克莫尔(Crickmore)等人.(1998)《微生物分子生物学评论》(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62:807-813)。在这个更可接受的分类中，每个毒素被指定一个唯一的名称，该名称合并了一个初级等级(一个阿拉伯数字)、一个二级等级(一个大写字母)、一个三级等级(一个小写字母)、以及一个四级等级(另一个阿拉伯数字)。在当前分类中，在初级等级中罗马数字已经换为阿拉伯数字。例如，在旧命名法下的“CryIA(a)”现在在当前命名法下是“Cry1Aa”。根据易卜拉欣(Ibrahim)等人(2010,《生物工程学》(Bioeng).蝽象，1:31-50)，Cry毒素仍然可以根据其昆虫宿主特异性被分为六个主要类别并且包括：组1-鳞翅目(例如Cry1、Cry9和Cry15)；组2-鳞翅目和双翅目(例如Cry2)；组3-鞘翅目(Cry3、Cry7和Cry8)；组4-双翅目(Cry4、Cry10、Cry11、Cry16、Cry17、Cry19和Cry20)；组5-鳞翅目和鞘翅目(Cry1I)；以及组6-线虫(Cry6)。Cry1I、Cry2、Cry3、Cry10和Cry11毒素(73–82kDa)是独特的，因为它们似乎是更大Cry1和Cry4蛋白(130–140kDa)的天然截短。Cry蛋白是在Bt的孢子形成阶段期间以晶态形式积聚为原毒素的球状蛋白质分子。在由有害生物摄取后，这些晶体典型地被溶解以释放原毒素，原毒素大小的范围可以为，例如，对于许多该鳞翅目活性的Cry蛋白质如Cry1和Cry9为从130-140kDa，并且对于鞘翅目活性的Cry3蛋白及鳞翅目/双翅目活性的Cry2蛋白为60-80kDa。在这些晶体被易感昆虫溶解后，这些释放的原毒素被昆虫肠道中的蛋白酶例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶加工，以产生一种抗蛋白酶的核心Cry蛋白毒素。这种蛋白水解加工涉及从各种Cry原毒素的不同区域移除氨基酸。例如，为130-140kDa的Cry原毒素典型地通过蛋白水解移除25-30个氨基酸的N-末端肽以及C-末端的大约一半的剩余蛋白，产生一种约60-70kDa成熟Cry毒素。为60-80kDa的原毒素，例如Cry2和Cry3，也被加工但是其程度不与更大的原毒素相同。与更大的原毒素相比，较小的原毒素典型地从N-末端移除相等或更多个氨基酸，但较少氨基酸被从C-末端移除。例如，Cry2家族成员的蛋白水解激活典型地涉及移除约40-50个N-末端氨基酸。许多Cry蛋白对特定的目标昆虫是相当有毒的，但许多具有窄的活性谱。Cry蛋白质通常具有五个保守序列域、以及三个保守结构域(参见，例如，德阿加迪尔(deMaagd)等人.(2001)《遗传学趋势》(TrendsGenetics)17:193-199)。第一保守结构域(称作结构域I)典型地由七个α螺旋组成并且涉及膜插入以及孔形成。结构域II典型地由三个安排为希腊钥匙构型的β片层组成，并且结构域III典型地由两个处于‘果冻卷’(‘jelly-roll’)构造的反平行的β片层(德阿加迪尔(deMaagd)等人，2001，同上)组成。结构域II和III涉及受体识别和结合，并且因此被考虑为毒素特异性的决定物。众多商业上有价值的植物，包括普通的农作物，易受植物有害生物(包括昆虫和线虫有害生物)的攻击的影响，导致作物产量和品质的实质性降低。例如，植物有害生物是在全世界重要农作物损失中的一个主要因素。由于昆虫有害生物和疾病，在中国每年收获的谷类损失约15％-20％。此外，由于无脊椎有害生物(包含昆虫)的侵染，仅在美国每年就损失大约80亿美元。昆虫有害生物对于菜农和果农，对于观赏性花卉的生产商，以及对于家庭花匠也是一种负担。昆虫有害生物主要是通过密集使用化学杀有害生物剂来控制，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫成长，预防昆虫摄食或繁殖，或者导致死亡而有效。生物性有害生物控制剂，例如表达杀有害生物毒素(如Cry蛋白)的苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)菌株，也已经应用至作物植物中，产生了令人满意的结果，提供化学杀有害生物剂的替代物或补充物。已经分离了编码这些Cry蛋白的一些的基因并且它们在异源性宿主(例如转基因植物)中的表达已经显示出提供了另一种用于控制经济上重要的昆虫有害生物的手段。因此可以达到良好的昆虫控制，但是某些化学品有时也能影响非靶标有益昆虫，并且某些生物制剂具有非常窄的活性谱。此外，某些化学和生物控制方法的继续使用增加了昆虫有害生物对此类控制措施产生抗性的机会。通过各种抗性管理实践已部分地缓和了这种状况，但仍需要开发新型并有效的有害生物控制剂，这些有害生物控制剂为农民提供经济利益并且是环境可接受的。特别需要是可以靶向更广谱的经济上重要的昆虫有害生物并有效控制昆虫品系的控制剂，这些昆虫品系对现有的昆虫控制剂是有抗性的或可以变得有抗性。概述鉴于这些需求，本专利技术的一个目的是通过提供新的苏云金杆菌(Bt)分离株连同可以用来控制多种植物有害生物的新颖基因和杀有害生物蛋白来提供新的有害生物控制剂。本专利技术提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织以及种子的杀有害生物活性的组合物以及方法。具体地，提供了包括从Bt分离的编码Cry蛋白的新颖多核苷酸的嵌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸分子，其包含编码对鳞翅目有害生物有毒的Cry蛋白的核苷酸序列，其中该核苷酸序列(a)与SEQ ID NO:1‑5中任一个或其毒素编码片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或(b)编码包含如下氨基酸序列的Cry蛋白，该氨基酸序列与SEQ ID NO:16‑25中任一个或其毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或(c)是(a)或(b)的合成序列，该合成序列具有针对在转基因生物中的表达进行了优化的密码子；或(d)在严格条件下与SEQ ID NO:1‑5中任一个或其毒素编码片段杂交，或与编码包含SEQ ID NO:16‑25中任一个或其毒素片段的氨基酸序列的Cry蛋白的第二核苷酸序列杂交；或(e)编码包含如下氨基酸序列的Cry蛋白，该氨基酸序列由于1‑50、1‑20或1‑10个氨基酸残基的添加、缺失和/或置换(例如，保守置换)而不同于SEQ ID NO:16‑25中任一个或其毒素片段的氨基酸序列；或(f)是(a)或(b)或(d)或(e)中所定义的核苷酸序列，其源自苏云金杆菌菌株。

【技术特征摘要】
1.一种核酸分子，其包含编码对鳞翅目有害生物有毒的Cry蛋白的核苷酸序列，其中该核苷酸序列(a)与SEQIDNO:1-5中任一个或其毒素编码片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或(b)编码包含如下氨基酸序列的Cry蛋白，该氨基酸序列与SEQIDNO:16-25中任一个或其毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或(c)是(a)或(b)的合成序列，该合成序列具有针对在转基因生物中的表达进行了优化的密码子；或(d)在严格条件下与SEQIDNO:1-5中任一个或其毒素编码片段杂交，或与编码包含SEQIDNO:16-25中任一个或其毒素片段的氨基酸序列的Cry蛋白的第二核苷酸序列杂交；或(e)编码包含如下氨基酸序列的Cry蛋白，该氨基酸序列由于1-50、1-20或1-10个氨基酸残基的添加、缺失和/或置换(例如，保守置换)而不同于SEQIDNO:16-25中任一个或其毒素片段的氨基酸序列；或(f)是(a)或(b)或(d)或(e)中所定义的核苷酸序列，其源自苏云金杆菌菌株。2.如权利要求1所述的核酸分子，其中该核苷酸序列包含SEQIDNO:1-5中任一个或其毒素编码片段。3.如权利要求1所述的核酸分子，其中该Cry蛋白包含SEQIDNO:16-25中任一个或其毒素片段的氨基酸序列。4.如权利要求1所述的核酸分子，其中该合成核苷酸序列包含SEQIDNO:6-15中任一个或其毒素编码片段。5.一种嵌合基因，其包含可操作地连接至如权利要求1-3中任一项所述的核酸分子的异源启动子。6.如权利要求5所述的嵌合基因，其中该异源启动子是植物可表达型启动子。7.如权利要求6所述的嵌合基因，其中该植物可表达型启动子选自：泛素、夜香树属黄病...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·梅，C·罗，Q·段，F·王，X·王，C·宁，
申请(专利权)人：先正达参股股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH