地衣芽孢杆菌HLS及其结球方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种地衣芽孢杆菌HLS及其结球方法与应用，所述地衣芽孢杆菌HLS的分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.14106，保藏日期：2017年5月8日，其结球方法如下：一、将地衣芽孢杆菌HLS接种至100mL的LB液体培养基中，37℃，170rpm，过夜培养；二、将培养好的液体菌以1％的接种量接种至100mL含有0.4～0.9mmol/L Cu

【技术实现步骤摘要】
地衣芽孢杆菌HLS及其结球方法与应用
本专利技术属于微生物
，涉及一株地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)HLS及其结球方法与应用。
技术介绍
在纺织、治金和日化等行业生产中需要用到大量染料，大多染料的结构较为复杂，稳定性较高，可降解性差，在生产过程中对环境的污染严重，染料废液的处理有待研究。传统的物理或化学处理方法在降解过程中会造成二次污染，采用生物学方法处理染料是较为环保的方式，利用酶制剂处理染料废水不仅效率高，而且操作简单。漆酶是在染料脱色方面应用最为广泛的一种酶制剂。地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)为芽孢杆菌属的革兰氏阳性菌，对外界有害因子抵抗力强，在极端环境中细胞质高度浓缩脱水形成芽孢，能够耐受高温、强酸和强碱等环境。地衣芽孢杆菌的芽孢蛋白具有漆酶的活性，漆酶能够催化许多芳香族化合物并有广泛的作用底物，可以降解环境中的有毒有害物质，去除染料及土壤中的杂酚油类物质，对于环境污染物的消除起着很大的作用。但天然酶稳定性差、易失活及不能重复使用，固定化酶技术克服了游离酶的不足，提高了酶的稳定性，降低了成本。目前关于地衣芽孢杆菌可以结球的报道很少。通过研究小球的特性及对不同类型染料的脱色效果，可以进一步推动芽孢杆菌在环境治理方面的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株地衣芽孢杆菌HLS及其结球方法与应用，该地衣芽孢杆菌HLS在培养过程中产生了一种粘性小球，该小球能够使染料脱色，并可以重复使用，天然形成了固定化酶。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：地衣芽孢杆菌HLS，分类命名为地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，保藏编号：CGMCCNO.14106，保藏日期：2017年5月8日。本专利技术的地衣芽孢杆菌HLS细胞大小为(0.5～0.8μm)×(1.5～2.5μm)，菌落乳白色、呈圆形，表面干燥光滑，培养3天后的菌落产生红色素。本专利技术的地衣芽孢杆菌HLS的V-P试验呈阳性，硝酸盐还原试验呈阳性，硝酸盐产气试验呈阳性。地衣芽孢杆菌HLS可利用麦芽糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖和蔗糖，地衣芽孢杆菌HLS可水解淀粉和明胶，地衣芽孢杆菌HLS为发酵型。本专利技术的地衣芽孢杆菌HLS可在LB培养基上生长，最适生长温度为37℃，最适生长pH为7.0。本专利技术的地衣芽孢杆菌HLS的16SrDNA序列只与地衣芽孢杆菌同源性为99％，结合菌体形态和生理生化特性，鉴定该菌株HLS为地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)。上述地衣芽孢杆菌HLS的结球方法，包括如下步骤：一、将地衣芽孢杆菌HLS接种至100mL的LB液体培养基中，37℃，170rpm，过夜培养；二、将培养好的液体菌以1％的接种量接种至100mL含有0.4～0.9mmol/LCu2+的LB液体培养基中，37℃，170rpm过夜培养，得到地衣芽孢杆菌HLS菌球。本专利技术筛选得到的地衣芽孢杆菌HLS在一定的培养条件下能够形成菌球，该菌球可以重复使用用于对染料脱色，因此省略了制备固定化细胞的过程。在pH为7.0时对结晶紫、刚果红和酸性媒介红B6h后的脱色率分别为46.87％、61.42％和31.44％。小球可以重复脱色，菌球重复使用3次依然对酸性媒介红B有脱色效果。保藏信息：分类命名：地衣芽孢杆菌BacillusLicheniformis；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所；保藏编号：CGMCCNo.14106；保藏日期：2017年5月8日。附图说明图1为菌株HLS的扫描电镜照片；图2为菌株HLS总DNA电泳图；图3为菌株HLS的16srDNAPCR结果；图4为菌株HLS的16srDNA胶回收结果；图5为菌株HLS结球状态；图6为菌株HLS菌球的形态，A：10×4倍视野，B：10×10倍视野，C：10×20倍视野，D：10×40倍视野；图7为菌株HLS菌球脱色效果；图8为菌球第1次脱色的照片(放大40倍)，A：刚果红，B：结晶紫，C：酸性媒介红B；图9为菌球第2次脱色的照片(放大40倍)，A：刚果红，B：结晶紫，C：酸性媒介红B；图10为菌球第3次脱色的照片(放大40倍)，A：刚果红，B：结晶紫，C：酸性媒介红B。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。实施例1地衣芽孢杆菌HLS的筛选：(1)从甘肃省皋兰县某小区旱柳树下采集土壤样品，取10g置于100mLM9培养基中，37℃震荡培养2d。(2)取5mL培养液接种于100mL含0.2mmol/LCu2+的富集培养基中，37℃震荡培养4d。再取2mL培养液接种于100mL含0.2mmol/LCu2+的富集培养基中，37℃震荡培养7d。(3)取培养液适当稀释后涂布于含0.2mmol/LCu2+的LB平板上，37℃培养3d。培养3d后，长出菌落，用0.1％丁香醛连氮溶液(无水乙醇溶解)定性检测细菌的漆酶活性，菌落显现红色至粉红色的即为产漆酶的细菌菌株。实施例2菌株HLS形态及生理生化特性：菌株HLS革兰氏染色显蓝紫色，为革兰氏阳性菌。菌株HLS的扫描电镜照片见图1。将培养了12h左右的菌体接种到各类糖的细菌微量生化反应管内，37℃培养24～48h，每个实验组均设置3组对照及空白对照。观察实验结果并记录(表1)。表1菌株HLS的生理生化特性注：+表示阳性-表示阴性实施例3菌株HLS的16srDNA序列分析：1、菌株HLS基因组的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180rpm，37℃培养过夜，采用SDS法提取菌株的总DNA，并进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。2、PCR扩增细菌的16srDNAPCR反应体系(20μL)：PermixTaq10μL，引物各(2.5μM)3.2μL，模板1μL，蒸馏水添加至20μL。反应条件：93℃预变性5min，94℃变性18s，56℃退火15s，72℃延伸78s，循环30次，72℃延伸7min。菌株HLS的16srDNA的PCR结果如图3所示。3、PCR扩增目的片段的纯化通过PCR扩增出大量的目的片段，经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯下切下含有目的条带的胶块，装入EP管中，利用试剂盒进行胶回收，效果如图4所示。4、16srDNA目的片段的克隆及转化PCR纯化产物与pMD18-T载体连接，16℃，30min。转化步骤：①取50μL感受态细胞于冰中融化；②将5μL的连接产物加入到已经融化的感受态细胞中，轻轻吸打混匀，冰浴30min；42℃保温45s，冰浴2～3min；③加入450μLSOC培养基，轻轻混匀，200rpm，37℃培养1h。④取适量上述培养产物均匀涂在含有氨苄青霉素的平板上，37℃培养过夜。5、转化子的筛选及菌液的制备用灭菌的枪头将白色菌落接种至2mL离心管中，200rpm，37℃，4h，用甘油保存。将菌液送至华大基因测序公司测序。经测序菌株HLS本文档来自技高网...

【技术保护点】
地衣芽孢杆菌HLS，其分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus Licheniformis，保藏编号：CGMCC NO.14106。

【技术特征摘要】
1.地衣芽孢杆菌HLS，其分类命名为地衣芽孢杆菌BacillusLicheniformis，保藏编号：CGMCCNO.14106。2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌HLS，其特征在于所述地衣芽孢杆菌HLS的DNA序列如SEQIDNO：1所示。3.权利要求1所述地衣芽孢杆菌HLS的结球方法，其特征在于所述方法步骤如下：一、将地衣芽孢杆菌HLS接种至100mL的LB液体培养基中，3...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪春蕾，孙海琼，赵敏，陶雷，吴莹，李德斌，汪傲，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23