高通量鉴定植物病毒的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种高通量鉴定植物病毒的方法及其应用，方法包括如下步骤：提取植物样本的总RNA，分离获取mRNA，将mRNA逆转录得到双链cDNA，然后扩增，得到DNA文库；将DNA文库进行转录组测序，获取reads:片段，将其拼接成contigs，然后组装成scaffolds；再与核酸数据库进行BLAST比对，获得比对上的第一结果文件，再进行处理，从中提取出查询序列；然后与核酸数据库进行BLAST比对，获得比对上的第二结果文件；再进行处理，鉴定出感染相应植物样本的病毒。本发明专利技术提供的高通量鉴定植物病毒的方法，可以提高鉴定效率和鉴定准确性，从而实现植物病毒的大规模筛查和诊断。

Method for high throughput identification of plant viruses and uses thereof

The invention relates to a method for high-throughput identification of plant virus and its application. The method comprises the following steps: extracting total RNA from plant samples, obtained from mRNA, mRNA reverse transcripted double stranded cDNA, and then amplified by DNA library; DNA library by transcriptome sequencing, obtain reads: fragment, the spliced contigs and then assembled into scaffolds; then BLAST compared with the nucleic acid database, to obtain the first results on the file, and then processed and extracted from the query sequence; then compare BLAST with nucleic acid database, obtained the second alignment results file; then, identified the corresponding plant samples of the virus infection. The present invention provides a method for high throughput identification of plant viruses, which can improve identification efficiency and identification accuracy, thereby achieving large-scale screening and diagnosis of plant viruses.

【技术实现步骤摘要】
高通量鉴定植物病毒的方法及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种高通量鉴定植物病毒的方法及其应用。
技术介绍
病毒(virus)，是一种包被于保护性的蛋白衣壳中的一个基因组核酸分子，可在适宜的寄主细胞内完成自身复制。病毒根据寄主的不同分为植物病毒，动物病毒，和噬菌体等。植物病毒俗称植物上的癌症，其流行和爆发严重威胁生产和人类食品安全。据不完全统计，全世界每年因植物病毒病造成的农业损失占粮食作物总产量的10％。对植物病毒进行快速，准确，大规模的诊断和鉴定，对于病毒病的防控来说是十分重要和紧迫的。传统检测植物病毒的方法包括：血清学检测、电子显微镜观察、指示植物接种、DNA扩增和芯片杂交等。但是这些传统方法存在耗时长，效率低，无法快速批量化鉴定等缺点；而且发现病毒的时间较晚，一般等到肉眼可见，或已经出现影响其他发育的症状才进行相应检测。因此，需要开发出新型的高通量鉴定病毒的方法，以避免现有技术中存在的不足。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术目的在于提供一种高通量鉴定植物病毒的方法及其应用，以提高鉴定植物病毒的效率和鉴定准确性，从而实现植物病毒的大规模筛查和诊断；方法操作简便，并且成本低，适合广泛使用。为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：本专利技术提供了一种高通量鉴定植物病毒的方法，包括如下步骤：S1：提取植物样本的总RNA，然后分离获取mRNA，将mRNA逆转录得到双链cDNA，然后扩增，得到DNA文库；S2：将DNA文库进行转录组测序，获取reads:片段，将reads:片段拼接成较长片段的重叠群(contigs)，然后组装成更长片段的重叠群(scaffolds)；S3：将scaffolds与核酸数据库进行BLAST比对，获得比对上的第一结果文件；S4：将第一结果文件进行处理，从中提取出第二查询序列(querysequences)；S5：将第二查询序列(querysequences)与核酸数据库进行BLAST比对，获得比对上的第二结果文件；S6：将第二结果文件进行处理，鉴定出感染相应植物样本的病毒。需要说明的是，S1中，可以采用试剂盒(QiagenRNeasyPlantMinikit)提取发病寄主中(植物叶子)的总RNA，然后分离总RNA获得mRNA，计算RNA质量和纯度(OD260/280，OD260/230)。在本专利技术的进一步实施方式中，S4中，处理包括步骤：S401：根据第一结果文件中的gi编号，通过病毒数据库获取病毒的信息；S402：提取第一结果文件中的第一查询序列(querysequences)及其对应的从属序列(subjectsequences)；S403：将S401和S402得到的所有信息注释到第一结果文件中，得到注释的第一结果文件；S404：在注释的第一结果文件中筛选出最小的e-value值对应的第一查询序列(querysequences)，即为第二查询序列(querysequences)。在本专利技术的进一步实施方式中，S6中，处理包括步骤：S601：在第二结果文件中筛选出最小的e-value值对应的第二查询序列(querysequences)，得到第三查询序列(querysequences)；S602：根据第三查询序列(querysequences)中对应的gi编号，在核酸数据库中获取物种的信息，并对病毒的信息进行标记；S603：提取S602得到的文件中的查询序列(querysequences)及其对应的从属序列(subjectsequences)，即为第四查询序列(querysequences)及其对应的从属序列(subjectsequences)；S604：将S603得到的所有信息注释到S602得到的文件中，得到注释的第二结果文件。在本专利技术的进一步实施方式中，S6中，同时出现在注释的第一结果文件和注释的第二结果文件中的病毒，即为鉴定出感染相应植物样本的病毒。在本专利技术的进一步实施方式中，S1中，扩增为进行15个PCR循环扩增。需要说明的是，进行15个PCR循环扩增，文库平均长度大约为322bp。在本专利技术的进一步实施方式中，S2中，转录组测序是采用IlluminaHiseq测序平台进行测序。在本专利技术的进一步实施方式中，S2中，reads:片段的长度为84～90bp。需要说明的是，其中，大部分的reads:片段的长度为90bp，少数为84～87bp。在本专利技术的进一步实施方式中，S2中，还包括步骤：将获取的reads:片段去除接头和引物，然后进行拼接。需要说明的是，优选还应该去除低质量片段。在本专利技术的进一步实施方式中，S2中，拼接是采用SOAPdenovo-trans软件拼接，scaffolds的长度大于或等于1000bp。需要说明的是，优选对scaffolds长度进行统计，并计算scaffoldN50。本专利技术还保护高通量鉴定植物病毒的方法在鉴定植物病毒种类中的应用。本专利技术提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本专利技术采用二代测序技术进行高通量鉴定植物病毒，效率高，鉴定准确，可以实现植物病毒的大规模筛查和诊断；(2)本专利技术提供的高通量鉴定植物病毒的方法可在植物早期未出现症状时及时发现感染的病毒，实现病毒的早期筛查和诊断，干预，极大降低了经济利益的损失；(3)本专利技术提供的高通量鉴定植物病毒的方法操作简便，并且成本低，适合广泛使用。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1为本专利技术实施例中的高通量鉴定植物病毒的方法的流程示意图；图2为本专利技术实施例中的对茄科的scaffold长度进行统计且计算得到的scaffoldN50结果图；图3为本专利技术实施例中得到的注释的第一结果文件结果图；图4为本专利技术实施例中得到的注释的第二结果文件结果图；图5为本专利技术实施例中鉴定出感染相应植物样本的病毒结果图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。本专利技术提供的高通量鉴定植物病毒的方法的流程示意图如图1所示。实施例以茄科植物蒜芥茄(Solanumsisymbriifolium)为例，采用本专利技术提供的高通量鉴定植物病毒的方法进行植物病毒鉴定，方法具体包括如下步骤。S1：采用试剂盒(QiagenRNeasyPlantMinikit)提取发病寄主中(植物叶子)的总RNA，然后分离总RNA获得mRNA，计算RNA质量和纯度(OD260/280，OD260/230)。将mRNA逆转录得到双链cDNA，然后进行15个PCR循环扩增，得到平均长度为322bp的DNA文库。S2：将DNA文库采用IlluminaHiseq测序平台进行转录组测序，获取reads:片段，大部分的reads:片段的长度为90bp，少数为84～87bp。将reads:片段去除接头和引物，然后采用SOAPdenovo-trans软件将reads:片段拼接成较长片段的重叠群(contigs)，然后组装成更长片段的重叠群(scaffolds)；对茄科的scaffolds长本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量鉴定植物病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：提取植物样本的总RNA，然后分离获取mRNA，将所述mRNA逆转录得到双链cDNA，然后扩增，得到DNA文库；S2：将所述DNA文库进行转录组测序，获取reads:片段，将所述reads:片段拼接成contigs，然后组装成scaffolds；S3：将所述scaffolds与核酸数据库进行BLAST比对，获得比对上的第一结果文件；S4：将所述第一结果文件进行处理，从中提取出第二查询序列；S5：将所述第二查询序列与核酸数据库进行BLAST比对，获得比对上的第二结果文件；S6：将所述第二结果文件进行处理，鉴定出感染相应植物样本的病毒。

【技术特征摘要】
1.一种高通量鉴定植物病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：提取植物样本的总RNA，然后分离获取mRNA，将所述mRNA逆转录得到双链cDNA，然后扩增，得到DNA文库；S2：将所述DNA文库进行转录组测序，获取reads:片段，将所述reads:片段拼接成contigs，然后组装成scaffolds；S3：将所述scaffolds与核酸数据库进行BLAST比对，获得比对上的第一结果文件；S4：将所述第一结果文件进行处理，从中提取出第二查询序列；S5：将所述第二查询序列与核酸数据库进行BLAST比对，获得比对上的第二结果文件；S6：将所述第二结果文件进行处理，鉴定出感染相应植物样本的病毒。2.根据权利要求1所述的高通量鉴定植物病毒的方法，其特征在于：所述S4中，所述处理包括步骤：S401：根据所述第一结果文件中的gi编号，通过病毒数据库获取病毒的信息；S402：提取所述第一结果文件中的第一查询序列及其对应的从属序列；S403：将所述S401和所述S402得到的所有信息注释到所述第一结果文件中，得到注释的第一结果文件；S404：在所述注释的第一结果文件中筛选出最小的e-value值对应的第一查询序列，即为第二查询序列。3.根据权利要求2所述的高通量鉴定植物病毒的方法，其特征在于：所述S6中，所述处理包括步骤：S601：在所述第二结果文件中筛选出最小的e-value值对应的第二查询序列，得到第三查询序列；S602...

【专利技术属性】
技术研发人员：严志祥，李景伟，
申请(专利权)人：郑州云基因数据科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41