一种提高北柴胡毛状根诱导效率及遗传转化效率的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种提高北柴胡毛状根诱导效率及遗传转化效率的方法及其应用。本发明专利技术基于对发根农杆菌菌株、侵染菌液OD值、共培养时间等条件的摸索，确认了提高发根农杆菌的侵染效率的最佳组合条件，相比传统的10％左右毛状根诱导率，本发明专利技术提供的技术方案获得的毛状根诱导率达70％‑85％。本发明专利技术提供了的提高北柴胡毛状根遗传转化效率的方法，可以获得80％以上的外源基因转化率，为北柴胡功能基因研究和/或北柴胡毛状根代谢产物的产业化提供了更好、更高效、更简便的选择。

Method for improving induction efficiency and genetic transformation efficiency of hairy root of Bupleurum chinense and application thereof

The invention provides a method for improving the induction efficiency and the genetic transformation efficiency of hairy roots of Bupleurum chinense and its application. The invention of Agrobacterium rhizogenes strains, infection of bacterium solution, co culture time conditions based on confirmed the optimal conditions to improve the infection efficiency of Agrobacterium rhizogenes, compared to about 10% traditional hairy root induction rate of hairy root was the technical proposal provided by the induction rate of 70% 85%. The invention provides a method for improving the efficiency of genetic transformation of hairy roots of Bupleurum chinense were the exogenous gene can be obtained more than 80% conversion rate, for honewort functional gene research and / or Bupleurum hairy root metabolites industrialization provides a better and more efficient and more convenient choice.

【技术实现步骤摘要】
一种提高北柴胡毛状根诱导效率及遗传转化效率的方法及其应用
本专利技术生物
，具体涉及一种提高北柴胡毛状根诱导效率及遗传转化效率的方法及其应用。
技术介绍
毛状根，又称发状根，发根，是由发根农杆菌含有的Ri质粒上的T-DNA插入到植株或器官、组织(包括愈伤组织)、单个细胞、原生质体的细胞核基因组，而在感染部位产生的大量副产物。毛状根的诱导培养可作为生物反应器，生产有应用价值的植物代谢产物。另外，还可通过发根农杆菌将外源基因导入，以调控目标代谢产物的合成。柴胡是我国典型的传统大宗药材，有2000多年的应用历史。是疏散退热、舒肝、升阳之要药。北柴胡(BupleurumchinenseDC.)是我国国家药典规定的柴胡基源植物之一，为伞形科柴胡属多年生草本植物。我国东北、华北、西北、华东、湖北、四川等地均有分布和种植，是柴胡药材的主要来源。目前已有多种植物包括药用植物具有毛状根诱导培养体系，但每种植物的诱导培养体系都存在差异，在一种植物上有效的方法，换一种植物往往难以成功。在摸索特定植物毛状根诱导培养体系过程中，通常是从发根农杆菌菌种的类别、植物外殖体类型、侵染方式、侵染时间等条件出发,通过试验获得最佳条件。在《北柴胡毛状根诱导及其植株再生体系的建立》(孙晶等，药学学报，2013)一文中，我们研究了从设计多种诱导条件出发，探索建立稳定的柴胡毛状根诱导体系。发根农杆菌A4侵染北柴胡无菌苗叶基部，共培养3天后，转入抑菌培养，10天开始出现毛状根，经4～5周培养，转为液体摇培，获得大量毛状根，诱导产生的毛状根可再生成植株。毛状根再生成植株有两种方式:一种是液体摇培的毛状根自发脱落形成幼苗的继续培养，另一种是将毛状根产生脱落的类愈伤组织置于经筛选的再生固体培养基上再生成植株。柴胡毛状根及其植株再生体系的建立，为开展柴胡次生代谢研究，尤其是利用农杆菌介导的遗传转化研究和利用奠定了基础。然而，此体系用于多基因转化毛状根的研究及应用，效率比较低，毛状根诱导率仅在10％左右。在《农杆菌诱导北柴胡毛状根体系建立及UGT基因功能初步研究》(孙晶等，微生物学，2014)一文中，参考前文提供的诱导方法，通过设计多种诱导条件，包括不同菌种种类、外植体类型、侵染方式和侵染时间等，探索建立稳定的北柴胡毛状根诱导体系。发现：在采用发根农杆菌A4侵染北柴胡无菌苗叶基部，菌液浸染20min，置于固体培养基(B5+乙酰丁香酮200μtmol/L+蔗糖20g/L或MS+NAA6mg/L+乙酰丁香酮200mol/L+蔗糖20g/L)共培养3d后，转入抑菌培养，10d左右发出毛状根。由此，建立了北柴胡毛状根诱导体系。诱导率仍然在10％左右。且文章指出：柴胡毛状根诱导率是否还可提高有待继续从菌株和诱导条件等方面摸索。此外，在《农杆菌诱导北柴胡毛状根体系建立及UGT基因功能初步研究》(孙晶等，微生物学，2014)一文中，“进行发根农杆菌介导的北柴胡BcUGT10基因的遗传转化初步研究”，但结果发现：“诱导产生的毛状根经25mgm潮霉素筛选获得3条抗性毛状根，PCR检测后，未得到阳性转化毛状根”本专利技术的目的在于提供一种能够提高北柴胡毛状根诱导率，并借以实现外源基因的遗传转化的方法。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种提高北柴胡毛状根诱导效率及遗传转化效率的方法及其应用。本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术第一方面提供了一种提高北柴胡毛状根诱导效率的方法，包括如下步骤：(1)获得用于侵染的外植体；(2)获得供侵染用的发根农杆菌菌液；(3)转化外植体进行共培养：将步骤1)所得的外植体置于步骤2)所得侵染用的发根农杆菌菌液中，摇培浸染；然后转入MS培养基，按照a)或b)处理：a)在黑暗条件下共培养3～5天；b)按照光照/黑暗(优选16小时光照/8小时黑暗)交替培养4～7天；(4)毛状根的诱导：取步骤3)处理的外植体置于抑菌培养基中，黑暗培养，诱导发根，获得诱导的毛状根。在本专利技术一实施例中，所述步骤(1)中，所述的获得用于侵染的外植体的步骤具体包括：消毒种子萌芽获得幼苗后，切去幼苗根部，至继代培养基中培养，获得无菌无根的分化小苗，即获得用于第一菌种侵染的外植体。在本专利技术一具体实施例中，种子消毒后接种于MS固体培养基中培养获得无菌幼苗。本领域技术人员可以理解的是，除本专利技术实施例所示示例之外，还可以采用其他的方法对种子进行消毒、除菌，并培养至种子萌芽，获得无菌幼苗。进一步地，所述获得的无菌无根的分化小苗置于无激素MS培养基上预培养0～3天后，获得用于第一菌种侵染的外植体；优选地，预培养0、1、2或3天。优选地，所述第一菌种为发根农杆菌A4、ACCC10060、ACCC15834、SW101中的一种或多种。在本专利技术一具体实施例中，所述继代培养基为含如下组分的MS培养基：6-BA2.5mg/L、IAA2.5mg/L、30g/L蔗糖、5g/L植物凝胶。在本专利技术一实施例中，所述步骤(1)中，取(优选为土壤中栽培的)柴胡幼苗的叶片和叶柄，经消毒除菌后获得所述用于第二菌种侵染的外植体。进一步地，所述获得的经消毒灭菌的柴胡幼苗的叶片和叶柄置于无激素MS培养基上预培养0～3天后，获得用于第二菌种侵染的外植体；优选地，预培养0、1、2或3天。更进一步地，所述消毒除菌的方法包括：采用75％的酒精浸泡30～50S，20％的次氯酸钠(NaClO)溶液封闭处理5-10min，无菌水冲洗3～5次。优选地，所述第二菌种为发根农杆菌SW101。在本专利技术一实施例中，所述步骤(2)中，所用菌株的菌液OD值为0.8～1.2。在本专利技术一优选实施例中，所述步骤(2)中，所用菌株的菌液OD值为0.8、1或1.2。在本专利技术一优选实施例中，所述步骤(3)中，所述摇培浸染的时间为20～25min。在本专利技术一实施例中，当所述步骤(3)取a)步骤时，所用菌株为发根农杆菌A4、ACCC10060、ACCC15834、SW101中的一种或多种。进一步地，当所述步骤(3)取a)步骤时，共培养时间为3、4或5天。在本专利技术一实施例中，当所述步骤(3)取b)步骤时，所用菌株为发根农杆菌SW101。进一步地，当所述步骤(3)取b)步骤时，交替培养4、5、6或7天。在本专利技术一实施例中，所述步骤(4)中，抑菌培养基为含500mg/L的头孢噻肟钠(或car)的MS培养基。本领域技术人员可以理解的是，除本专利技术实施例所示示例之外，还可以采用其他本领域技术人员所熟知的抑菌培养基，比如采用400或300mg/L的头孢噻肟钠(或car)的MS培养基。在本专利技术一实施例中，所述步骤(4)中，黑暗培养20～30天后获得诱导的毛状根。在本专利技术一实施例中，所述步骤(4)中，获得的诱导的毛状根，每30天继代一次，共抑菌处理90～100天，转入普通培养基中(如无头孢噻肟钠(或卡纳)的MS液体培养基)，继续振荡培养(具体地，150rpm黑暗培养)，获得大量诱导的毛状根。本专利技术第二方面提供了一种提高北柴胡毛状根遗传转化效率的方法，包括如下步骤：(1)获得用于侵染的外植体；(2)获得供侵染用的发根农杆菌菌液，所述发根农杆菌携带外源基因；(3)转化外植体进行共培养：将步骤1)所得的外植体置于步骤2)所得侵染用的发根农杆菌菌液中，摇培浸染；然后转本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高北柴胡毛状根诱导效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)获得用于侵染的外植体；(2)获得供侵染用的发根农杆菌菌液；(3)转化外植体进行共培养：将步骤1)所得的外植体置于步骤2)所得侵染用的发根农杆菌菌液中，摇培浸染；然后转入MS培养基，按照a)或b)处理：a)在黑暗条件下共培养3～5天；b)按照光照/黑暗交替培养4～7天；(4)毛状根的诱导：取步骤3)处理的外植体置于抑菌培养基中，黑暗培养，诱导发根，获得诱导的毛状根。

【技术特征摘要】
1.一种提高北柴胡毛状根诱导效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)获得用于侵染的外植体；(2)获得供侵染用的发根农杆菌菌液；(3)转化外植体进行共培养：将步骤1)所得的外植体置于步骤2)所得侵染用的发根农杆菌菌液中，摇培浸染；然后转入MS培养基，按照a)或b)处理：a)在黑暗条件下共培养3～5天；b)按照光照/黑暗交替培养4～7天；(4)毛状根的诱导：取步骤3)处理的外植体置于抑菌培养基中，黑暗培养，诱导发根，获得诱导的毛状根。2.如权利要求1所述的提高北柴胡毛状根诱导效率的方法，其特征在于，所述步骤(1)中具体包括a)或b)：a)消毒种子萌芽获得幼苗后，切去幼苗根部，至继代培养基中培养，获得无菌无根的分化小苗，获得用于侵染的外植体；或b)取柴胡幼苗的叶片和叶柄，经消毒除菌后获得用于侵染的外植体。3.如权利要求2所述的提高北柴胡毛状根诱导效率的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述继代培养基为含如下组分的MS培养基：6-BA2.5mg/L、IAA2.5mg/L、30g/L蔗糖、5g/L植物凝胶。4.如权利要求1所述的提高北柴胡毛状根诱导效率的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所用菌株的菌液OD值为0.8～1.2。5.如权利要求1所述的提高北柴胡毛状根诱导效率的方法，其特征在于，所述步骤(3)...

【专利技术属性】
技术研发人员：隋春，吴素瑞，魏建和，金钺，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11