一种玉米自交系茎尖活体转化方法技术

本发明专利技术属于作物遗传育种领域，涉及一种玉米自交系SL1303茎尖活体转化方法，该方法是以玉米自交系SL1303为受体材料进行农杆菌介导的茎尖活体转化转入外源基因，获得转基因玉米。该方法与传统的农杆菌介导转基因方法相比，具有许多不可比拟的优势：成本低，操作简便，不受季节、植物发育时期等因素的限制，而且当代即可获得转基因的种子，T2代可获得纯合的转基因株系，无需组培再生阶段，对于保持主栽品种的生产力而改善其某一性状具有特殊的优势，有望发展为玉米转基因的常规技术，在提高玉米的品质性状和抗逆性能等方面的品种改良中发挥重要作用。

Method for in vivo conversion of stem tip of Maize Inbred Line

The invention belongs to the field of Crop Genetics and breeding, relates to a maize inbred line SL1303 stem tip in vivo transformation method, the method is based on the maize inbred line SL1303 as the acceptor stem tip in vivo by Agrobacterium mediated transformation of exogenous gene into transgenic corn. This method with the conventional Agrobacterium mediated transgenic methods, has many incomparable advantages: low cost, simple operation, is not affected by the factors of seasons, plant development and other restrictions, but also the modern can obtain transgenic seeds, T2 generation can obtain homozygous transgenic lines, without regeneration stage. To keep the main varieties of productivity and the improvement of a character has a special advantage, in order to develop the conventional technology of transgenic maize, and play an important role in improving the quality and improvement of Maize Varieties Resistance in other aspects.

【技术实现步骤摘要】
一种玉米自交系茎尖活体转化方法
本专利技术属于作物遗传育种领域，具体涉及一种玉米自交系茎尖活体转化方法。我们将玉米PIFs基因在玉米自交系SL1303中进行农杆菌介导的茎尖活体转化，将含有除草剂筛选标记的外源基因ZmPIF1和ZmPIF3转入到玉米茎尖，通过除草剂草丁膦筛选获得了阳性植株，并进行PCR检测，通过正交实验对转化条件进行综合研究，创建了适合玉米自交系SL1303农杆菌介导的茎尖活体转化的最优方案。农杆菌介导的茎尖活体转化与传统的农杆菌介导转基因方法相比，具有许多不可比拟的优势：成本低，操作简便，不受季节、植物发育时期等因素的限制，有望发展为玉米转基因的常规技术，为今后利用该方法进行玉米的转基因提供坚实的基础。
技术介绍
1植物转基因的方法植物转基因是利用重组DNA技术将克隆到的优良目的基因导入植物细胞或组织，并在其中进行表达，从而获得具新性状的植物。这一技术绕过了物种生殖隔离的障碍，使基因交流的范围扩大到整个生物界，可将从细菌、病毒、动物、远缘植物甚至人工合成的基因导入植物(魏松红等，2002)。自1984年，世界第一例转基因植物——烟草问世以来，转基因植物产生至今仅20多年时间，其研究和应用得到了非常迅猛的发展，常规的植物转基因方法已日趋成熟。大体可分为物理诱导DNA直接插入法、化学诱导DNA直接插入法以及载体转化法三种转化方法。1.1物理诱导DNA直接插入法物理诱导DNA直接插入法包括电激法、超声波介导法、子房注射法、花粉管通道法和基因枪法等。1986年Fromm等人首次成功用电激法转化了玉米原生质体(Frommetal.,1986)。张宏等人利用超声波法转化玉米愈伤组织获得转基因植株(张宏等，1997)。1993年丁群星等用子房注射法把Bt基因导入玉米，成功获得了转基因植株(丁群星等，1993)。基因枪法是植物遗传转化比较常用的方法之一，基因枪法由美国Cornell大学的Sanford等研究提出(Sanfordetal.,1987)。其原理是通过亚精胺、CaCl2等试剂将DNA包被在重金属颗粒(如钨粉、金粉等)上制成微弹，利用基因枪产生的高压冲力将携带外源目的基因的微弹直接导入受体细胞，外源基因随机整合到植物染色体中，从而实现外源基因在被转化植物中的表达和稳定遗传(李宝山，2008)。1987年,Klein等首次将基因枪法应用于植物转基因研究，并于1989年第一次使用基因枪法转化玉米获得成功(Kleinetal.,1989)。1.2化学诱导DNA直接插入法化学诱导DNA直接插入法主要包括PEG介导法和脂质体介导法。PEG介导法主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L‐鸟氨酸、磷酸钙及存在高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子(刘俊等，2005)。PEG介导法目前在玉米中得到了应用(Liangetal.,2014)。脂质体介导法是通过植物原生质体的吞噬或与细胞膜的融合作用把被脂质体包装成球状的外源DNA转入受体细胞中。脂质体介导法一般应用动物细胞转化，植物细胞转化的应用还比较少。王瓞等人利用烟草研究过脂质体介导基因转染的最优条件(王瓞等，1997)。脂质体介导法和PEG法都是以植物的原生质体为受体材料，因此这两种方法对于原生质体再生困难的植物来说，受到了一定的限制。1.3载体转化法载体转化法主要有病毒介导法和农杆菌介导法两种。病毒介导法主要是以双链DNA病毒作为载体，去除有关的致病性基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整株植物，病毒介导法曾被用于油菜的转化研究(王苏燕等，1997)。农杆菌介导法是一种天然的基因转化方法。目前，农杆菌介导法是玉米转基因最常用的方法，本研究玉米中的转化也是采用的农杆菌介导法，因此将在下文作更为详细的说明。农杆菌介导法与其他方法相比，具有转化效率较高、插入外源DNA片段大小明确、造成最小的DNA重排、多拷贝整合现象较少、不易发生基因沉默、能够导入大片段DNA、成本较小、操作简便等几大优势。2农杆菌介导法的原理农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(Agrobacterium)细菌，用于植物转化的农杆菌分为根瘤农杆菌和发根农杆菌。根瘤农杆菌应用更广，根瘤农杆菌中含有肿瘤诱导(Ti)质粒，Ti质粒上含有可转移DNA(T‐DNA)区、毒性区(Vir区)以及冠廖碱代谢基因编码区。T‐DNA两端是两个25bp的重复序列，分别称为左边界和右边界，两个边界序列之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘦碱合成基因。Vir区中也含有多个基因段，如virA、virB、virC、virD、virE、virG、virH等，每个基因段都含有多个基因。当植物受到伤害时，分泌含有酚类化合物的汁液，这些酚类化合物一方面通过染色体毒性基因(chvA、chvB等)介导的趋化性促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞表面；另一方面则被Ti质粒上由virA和virG组成的双组分调节系统识别，从而诱导其他vir基因的表达。vir基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌T‐DNA两端25bp序列，进而将T‐DNA以单链的形式切割下来，同时，Vir基因编码的virE2能够与单链T‐DNA结合，形成T‐复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质(Juhasetal.,2008)。之后便是宿主细胞的转运过程，激活Ti质粒上处于反式位置上的一段T‐DNA的转移，并插入到植物基因组中，使其携带的目的基因在植物中得以表达。反应过程主要包括以下几步:(1)农杆菌对植物伤口的识别与吸附；(2)virG的信号传导及vir基因的诱导表达；(3)T‐DNA复合物的形成并通过农杆菌进入植物细胞；(4)T‐DNA复合物的成熟；(5)T‐DNA整合进植物基因组并进行表达(Gelvin，2010)。3农杆菌介导法的发展历史发展一种成熟的方法用于农杆菌介导的遗传转化是一个非常复杂的任务，因为必须了解影响T‐DNA传递到愈伤组织的所有因素，然后还要诱导愈伤组织再分化形成再生植株。植株再生后，还需要进行进一步的分析，以检查T‐DNA的结合及稳定性，并获得最终转化效率参数。农杆菌介导法从1983年创建以来，在双子叶植物遗传转化中得到广泛应用，但玉米起初却一直难以运用这种方法进行转化。因为单子叶植物并不是农杆菌的天然宿主，Portrykus曾认为农杆菌转化单子叶植物是不可能的(Potrykus，1990，1991)。禾谷科作物如水稻、小麦、玉米都是单子叶植物，是人类重要的粮食作物，利用基因工程技术对这类植物进行研究具有十分重要的价值。随着对农杆菌转化植物细胞的原理进行系统研究，发现农杆菌对单子叶植物浸染的不敏感性，可能是因为单子叶植物创伤后，在伤口附近往往发生木质化或硬化，而且没有明显的细胞分裂发生，内源信号分子相对不足，不能形成足量的诱导vir区基因表达的酚类化合物(Amoahetal.,2001)。1984年，Hernalstenns等通过农杆菌介导法成功转化单子叶植物石刁柏的应用报道，首次证实了根癌农杆菌是可以转化单子叶植物的，并为根癌农杆菌转化单子叶植物的研究提供了理论依据和技术支撑，为近年来单子叶植物的转化研本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玉米自交系SL1303茎尖活体转化方法，其特征在于，以玉米自交系SL1303为受体材料进行农杆菌介导的茎尖活体转化转入外源基因，获得转基因玉米。

【技术特征摘要】
1.一种玉米自交系SL1303茎尖活体转化方法，其特征在于，以玉米自交系SL1303为受体材料进行农杆菌介导的茎尖活体转化转入外源基因，获得转基因玉米。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以玉米自交系SL1303为受体材料的进行农杆菌介导的茎尖活体转...

【专利技术属性】
技术研发人员：高勇，陈建民，居鹏，张冬平，陶海霞，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32