外泌体、其制备方法及其在制备治疗肺癌的药物中的应用技术

本发明专利技术涉及一种外泌体、其制备方法及其在制备治疗肺癌的药物中的应用。该制备方法通过采用KRN7000和ATP刺激细胞分泌外泌体。本发明专利技术所提供的制备方法能够高效地在体外制备外泌体。本发明专利技术还提供了上述方法制备的外泌体，其具有较强的细胞毒性作用以及抗肺部肿瘤活性。本发明专利技术还提供了上述外泌体在制备治疗肺癌的药物中的应用。

Exocrine body, process for preparing the same, and the use thereof in the preparation of a medicament for the treatment of lung cancer

The present invention relates to an exocrine body, a process for its preparation and its use in the preparation of a medicament for the treatment of lung cancer. The preparation method uses KRN7000 and ATP to stimulate cells to secrete exocrine bodies. The preparation method provided by the invention can efficiently prepare an exocrine body in vitro. The present invention also provides an extracellular body prepared by the said method, which has strong cytotoxicity and anti lung tumor activity. The present invention also provides the use of the said exocrine body in the preparation of a medicament for treating lung cancer.

【技术实现步骤摘要】
外泌体、其制备方法及其在制备治疗肺癌的药物中的应用
本专利技术涉及一种外泌体、其制备方法及其在制备治疗肺癌的药物中的应用，属于生物医药

技术介绍
随着恶性肿瘤对人类生存健康的威胁日益严重，肿瘤诊疗的新模式、新方法也在不断涌现。外泌体在肿瘤发生、发展机制中扮演着重要角色，其在肿瘤学中是一个新兴研究领域，近年来取得了很多突破，在肿瘤治疗上具有较好前景。外泌体(exosome)是由多种活细胞分泌的囊泡小体，其中含有蛋白质和RNA等多种关键组分，外泌体在多种生理和病理过程中发挥着重要作用，包括恶性肿瘤。外泌体可以用于肿瘤的免疫治疗，Rao等人的研究表明(Raoetal，Hepatology，2016)，肿瘤细胞来源的外泌体可以通过DC介导的免疫反应起到抑制肝癌动物模型和人类肿瘤生长的作用。另有研究证明(Katakowskietal，CellMolecularNeurobiology，2016)，由于外泌体直径较小，可透过血脑屏障进入脑部血循环，外泌体可以将抗肿瘤的RNA和蛋白质带入，对脑部原发性肿瘤发挥治疗作用。此外，自然杀伤T细胞(NK细胞)也可以通过释放含有穿孔素和颗粒酶的外泌体发挥直接抗肿瘤作用(Luginietal，JournalofImmunology，2012)。与肿瘤的免疫细胞治疗相比，外泌体治疗具有一定优势。Helmlinger等人的研究表明(Helmlingeretal，NatureMedicine，1997)，对实体肿瘤进行免疫细胞治疗的作用效果不显著很大程度上是由于肿瘤的酸性微环境所引起；Fischer等人的体外研究试验也表明(Fischeretal，ClinicalImmunology，2000)，如果细胞外环境的pH为酸性，NK细胞和LAK细胞的穿孔素/颗粒酶释放，以及Fas/FasL作用都会被抑制，这意味着这些免疫细胞无法充分发挥其细胞毒作用。然而有研究证实(Parolinietal，JournalofBiologicalChemistry，2009)，对于外泌体而言，酸性环境更有助于外泌体被肿瘤细胞摄取吸收，以进一步发挥外泌体的抗肿瘤生物学活性。以上说明，利用外泌体制备抗肿瘤药物具有很大的应用前景。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells，CIK细胞)是由人外周血或脐带血等来源的单个核细胞在体外用多种细胞因子与CD3抗体共同培养后获得的一群异质细胞。CIK细胞同时具有T淋巴细胞的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀肿瘤活性的特点，被认为是肿瘤过继免疫治疗的新希望(朱子杰等人，医药卫生：全文版，2016)。基础和临床研究均表明，CIK细胞在多种肿瘤的治疗过程中均表现出一定疗效，但关于CIK细胞通过外泌体发挥治疗作用还未见报道。KRN7000是从海绵组织中分离得到的一种α-半乳糖神经酰胺(α-galactosylceramide)，其具有广泛的生物活性。研究表明，KRN7000是一种选择性CDld蛋白的配体，通过活化NK细胞促进干扰素γ(IFN-γ)和白介素4(IL-4)的释放(冯俊娜等人，有机化学，2015)，在抗肿瘤、抗病毒、延缓或预防显性糖尿病的发病等方面均发挥作用。但KRN7000对于外泌体的作用未见报道。三磷酸腺苷(ATP)在细胞内提供代谢需要的能量，从而支持细胞的功能，如蛋白质合成、细胞膜合成、细胞分化等。研究表明，ATP可以诱导人巨噬细胞和啮齿类动物胸腺细胞死亡(Takenouchietal.，ImmunologyLetters，2015)。P2X7受体是ATP门控阳离子通道受体，其中P2X7受体信号通路与IL-1β、IL-6、COX-2等多种炎症因子的生成和释放相关，在多种疾病的发病过程中起到了至关重要的作用(Guetal.，AmericanJournalofPhysiology-CellPhysiology，2000)。然而ATP对于外泌体的作用仍未见到有相关研究。综上，CIK细胞来源外泌体的抗肿瘤活性仍未被充分证实。此外，将KRN7000和ATP协同作用于CIK细胞的培养及其对CIK细胞来源外泌体的活性作用未见报道。如何使用经济高效的方法在体外制备具有治疗肿瘤活性的外泌体，并提高其临床应用性，仍有待进一步研究。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种外泌体及其制备方法，该制备方法能够提高外泌体的抗肺部肿瘤活性。本专利技术的目的还在于提供上述外泌体在制备治疗肺癌的药物中的应用。为达到上述目的，本专利技术首先提供了一种外泌体的制备方法，其包括以下步骤：(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ，于37℃、5％CO2条件下进行培养；(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2，刺激细胞的生长和增殖；(3)培养第3天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并300U/ml的添加量补加人重组白介素2；(4)培养第7天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；(5)培养第14天，在无血清培养基中加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM，孵育30分钟后，收获细胞培养液的上清液并提取得到所述外泌体；该方法还包括：在步骤(2)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000，在步骤(4)中加入KRN7000和ATP储存液，KRN7000的添加量为70ng/ml，ATP的终浓度为4mM；或者，在步骤(1)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000，在步骤(4)中加入KRN7000和ATP储存液，KRN7000的添加量为35ng/ml，ATP的终浓度为4mM；或者，在步骤(2)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000，在步骤(4)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000；或者，在步骤(1)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000。在上述制备方法，所采用的无血清培养基可以是本领域常用的无血清培养基；“据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液”中的半量换液可以根据常规方式进行，一般是在第3、5、7、9、11、13天进行；如果没有特殊说明，所有的浓度、添加量均以无血清培养基的体积为基准进行计算，半量换液之后补加人重组白介素2时也是以无血清培养基的总体积为基准进行计算。在本专利技术提供的外泌体的制备方法中，细胞由脐血单个核细胞诱导获得，其中在细胞培养的过程中加入KRN7000、ATP储存液，可以有效增强外泌体的细胞毒性作用，大大增强其杀伤肿瘤细胞的作用效果。根据本专利技术的第一种优选技术方案，上述制备方法可以包括以下具体步骤：(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ，于37℃、5％CO2条件下进行培养；(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2、以35ng/ml的添加量加入KR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种外泌体的制备方法，其包括以下步骤：(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×10

【技术特征摘要】
1.一种外泌体的制备方法，其包括以下步骤：(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ，于37℃、5％CO2条件下进行培养；(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2，刺激细胞的生长和增殖；(3)培养第3天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；(4)培养第7天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；(5)培养第14天，在无血清培养基中加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM，孵育30分钟后，收获细胞培养液的上清液并提取得到所述外泌体；该方法还包括：在步骤(2)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000，在步骤(4)中加入KRN7000和ATP储存液，KRN7000的添加量为70ng/ml，ATP的终浓度为4mM；或者，在步骤(1)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000，在步骤(4)中加入KRN7000和ATP储存液，KRN7000的添加量为35ng/ml，ATP的终浓度为4mM；或者，在步骤(2)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000，在步骤(4)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000；或者，在步骤(1)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000。2.根据权利要求1所述的制备方法，其包括以下步骤：(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ，于37℃、5％CO2条件下进行培养；(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，刺激细胞的生长和增殖；(3)培养第3天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；(4)培养第7天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2、以70ng/ml的添加量加入KRN7000，并加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并补加300U/ml的人重组白介素2；(5)培养第14天，在培养基中加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM，孵育30分钟后，收获细胞培养液的上清液并提取得到所述外泌体。3.根据权利要求1所述的制备方法，其包括以下步骤：(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，于37℃、5％CO2条件下进行培养；(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2，刺激细胞的生长和增殖；(3)培养第3天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺飞，李涛，张凡，李振华，杨乐，吴东栋，滕铁山，姬新颖，
申请(专利权)人：贺飞，李涛，张凡，李振华，杨乐，吴东栋，滕铁山，姬新颖，
类型：发明
国别省市：北京,11