一种利用耐乙醇片球菌生产含GABA发酵酒的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用耐乙醇片球菌生产含GABA发酵酒的方法，属于发酵型功能饮品加工领域。首次分离得到既能耐受乙醇，又具有生产GABA能力的耐乙醇片球菌CICC 6282，专利菌保藏号为CGMCC NO.13929。本发明专利技术方法利用耐乙醇片球菌CICC 6282对酒精的耐受性，可作为发酵菌种，解决发酵过程中酒精累积与产GABA微生物无法细胞繁殖及累积GABA的矛盾。以芦笋等果蔬为原料，利用耐乙醇片球菌CICC 6282，通过分步控制发酵条件和外源添加谷氨酸或谷氨酸钠，发酵生产含γ‑氨基丁酸发酵酒。该方法具有简化发酵工艺、降低生产成本、操作简便等优点。

Method for producing fermented wine containing GABA by utilizing ethanol resisting coccus

The invention discloses a method for producing fermented wine containing GABA by utilizing ethanol resisting coccus, belonging to the processing field of fermented functional drinks. Isolated for the first time can be tolerated with ethanol, GABA production capacity of ethanol tolerance Pediococcus CICC patent 6282, bacteria preservation number is CGMCC NO.13929. The method of the invention utilizes the ethanol tolerance of Pediococcus CICC 6282 for alcohol, can be used as fermentation, to solve the contradiction in the fermentation process of alcohol accumulation and GABA producing microbial to cell proliferation and accumulation of GABA. Asparagus and other fruits and vegetables as raw materials, using ethanol Pediococcus CICC 6282, step by step through the control of fermentation conditions and exogenous glutamate or glutamate, gamma aminobutyric acid production with fermented wine fermentation. The method has the advantages of simplifying fermentation process, reducing production cost and easy operation.

【技术实现步骤摘要】
一种利用耐乙醇片球菌生产含GABA发酵酒的方法
本专利技术涉及一种利用耐乙醇片球菌（Pediococcusethanolidurans）生产含GABA发酵酒的方法，属于发酵型功能饮品加工领域。
技术介绍
芦笋(AsparagusofficinalisLinn.)又名石刁柏，享有“蔬菜之王”美称，不仅含有多种维生素和氨基酸及硒、钼、锰等微量元素，而且富含有多种活性成分，如芦笋黄酮、皂苷、多糖类物质，具有降血脂、降血糖和降血压、增强免疫力、抗氧化、抗癌等药理作用。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，简称GABA），又称4-氨基丁酸、氨酪酸、哌啶酸，是一种普遍存在的非蛋白质氨基酸，是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质。它由谷氨酸脱羧酶（GAD）催化L-谷氨酸发生不可逆的α-脱羧反应而生成。它具有多种生理功能，如调节血压、治疗癫痫、促进细胞新陈代谢、保护肝脏、促进生长激素分泌、预防肥胖、促进酒精代谢等功效。目前GABA主要生产方法包括化学合成和生物合成。化学合成过程中所用化学溶剂具有毒性和腐蚀性，产品中副产物多，缺乏安全性；相反，生物合成生产过程条件温和、环境污染较低，且产品中副产物少、安全性高。因此利用微生物生产GABA，不受资源、环境和空间的限制，具有显著的优点。2009年我国卫生部批准希氏乳杆菌发酵生产的GABA为新资源食品，可用于普通食品及保健食品的生产。在我国的专利及文献中有利用微生物发酵生产GABA的方法，如乳酸乳球菌(专利号ZL201310486474.7)、短乳杆菌(专利号ZL200510049188.X)、植物乳杆菌（专利号ZL201010167058.7）、嗜热链球菌（专利号ZL201410480097.0）、发酵乳杆菌(专利号ZL201210136696.1）、屎肠球菌（专利号ZL200910114018.3）、红色红曲霉(专利号ZL201010167058.7)、酿酒酵母（专利号ZL201010194431.8）等。片球菌为有益的乳酸菌，在参与肉类、蔬菜及白酒的发酵过程中，往往会产生一些发酵食品的风味物质。刘莉萌等在文献（酿酒科技,2007,2:22-28）中报道：从不同白酒酒醅发酵窖池中分离出20株片球菌，包括耐乙醇片球菌、戊糖片球菌及窖池片球菌等，并指出窖池中片球菌种类及数量是影响白酒风味的重要因素。陈功等在文献（食品与发酵工业,2013,39(3):1-4）中研究表明耐乙醇片球菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌等乳酸菌是四川泡菜发酵的优势菌群，是影响四川泡菜风味物质及功能性的重要因素。可见，耐乙醇片球菌属于有益的乳酸菌，可用于普通食品的生产与加工。通过上述专利文献和非专利文献的检索，但目前尚未见有耐乙醇片球菌产γ-氨基丁酸及其应用的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用耐乙醇片球菌为菌种，分步控制发酵条件以解决发酵过程中酒精累积与产GABA微生物无法细胞繁殖及累积GABA的矛盾。耐乙醇片球菌既能耐受一定浓度酒精而生长繁殖，又可以利用谷氨酸脱羧酶生产GABA。本专利技术通过分步控制发酵条件，既可以深层发酵产生酒精，又能生产γ-氨基丁酸，达到生产含γ-氨基丁酸发酵酒的目的，简化了发酵工艺、提高了设备利用率和降低了生产成本，同时提升了发酵酒饮品的保健功能，属于发酵型功能饮品加工领域。本专利技术提供一种利用耐乙醇片球菌生产含GABA发酵酒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以新鲜芦笋、山楂等果蔬为原料，洗净、加水破碎，转移至发酵罐中匀浆，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解，获得酶解液后灭菌；(2)接种酿酒酵母CICC1001进行第一阶段发酵，当乙醇浓度达到4%以上时，获得第一发酵液；(3)向第一发酵液接入耐乙醇片球菌CGMCCNO.13929，进行第二阶段初期发酵，然后加入谷氨酸或谷氨酸钠，进行第二阶段后期发酵，当发酵液中GABA含量高于200mg/L时，获得第二发酵液；(4)将所述第二发酵液混匀后，离心、均质及过滤除菌后，制得含GABA发酵酒。步骤（2）中所述的酿酒酵母CICC1001，静置厌氧发酵，控制发酵温度为28-40℃，发酵时间为36-96h，乙醇浓度为4%-12%；步骤（3）中所述的耐乙醇片球菌CICC6282，菌种保藏号CGMCCNO.13929，保藏日期为2017年3月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；初期发酵时间为16-36h，控制谷氨酸或谷氨酸钠（MSG）终浓度为0.5-2g/L，发酵温度为28-40℃，后期发酵时间为60-120h，摇床转速为80-150r/min，GABA浓度为200-600mg/L。本专利技术的优点：首次发现耐乙醇片球菌具有很高的谷氨酸脱羧酶活性，可深层发酵生产γ-氨基丁酸。本专利技术方法利用耐乙醇片球菌对酒精的耐受性，可作为发酵菌种，通过分步控制发酵条件，解决发酵过程中酒精累积与产GABA微生物无法细胞繁殖及累积GABA的矛盾，最终达到生产含γ-氨基丁酸发酵酒的目的，简化了发酵工艺，提高了设备利用率，大大降低了生产成本。附图说明图1为本专利技术中薄层层析法检测耐乙醇片球菌产GABA。图2为本专利技术中HPLC法检测耐乙醇片球菌产GABA。具体实施方式下面将结合具体实施例来进一步对本专利技术作详细描述，以使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚。以下实施例仅仅用于举例说明，并不对本专利技术构成任何限制。实施例1本专利技术产GABA耐乙醇片球菌的分离方法，采用梯度稀释混菌法，从新疆巴音郭楞蒙古自治州博湖县发酵辣椒酱中分离。包括以下步骤：取25 g的辣椒酱加入到225 mL无菌生理盐水中，用涡旋振荡器摇匀，制得10-1的稀释液，梯度稀释以制得10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。分别取100 μL稀释液涂布于添加了2%CaCO3的MRS培养基，置于37 ℃下培养48 h。挑取有溶钙圈的单菌落进行平板划线纯化，并将分离的菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC6282。将菌株CICC6282接种于MRS固体培养基，置于37℃培养48h，菌落呈乳白色，圆形扁平，不透明，边缘整齐；显微镜下观察菌体呈球状，大小为（0.3-0.5）μm，成对或呈四联球状排列，革兰氏染色阳性。通过接触酶实验和API50CHL试剂条对菌株CICC6282的酶活性、碳源利用等生理生化特征检测，结果显示菌株CICC6282接触酶反应阴性，能够利用半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、七叶灵、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、龙胆二糖为碳源生长，不能利用其他的碳源。菌株CICC6282的16SrDNAPCR扩增产物大小约为1.4kb，在GenBank上的登录号为KY681774。将该序列通过EzBioCloud数据库比对，结果显示：同CICC6282的16SrDNA序列相似性高于97%的序列全部是片球菌属的模式菌株序列，其中菌株CICC6282同耐乙醇片球菌PediococcusethanoliduransZ-9T的16SrDNA序列相似性最高，为99.86%。以LactobacillusozensisMizu2-1T序列为外群，构建CICC6282与相关近缘模式菌株的系统发育树，结果显示，通过1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用耐乙醇片球菌生产含GABA发酵酒的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）以新鲜芦笋、山楂等果蔬为原料，洗净、加水破碎，转移至发酵罐中匀浆，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解，获得酶解液后灭菌；（2）接种酿酒酵母CICC 1001进行第一阶段发酵，当乙醇浓度达到4%以上时，获得第一发酵液；（3）向第一发酵液接入耐乙醇片球菌CGMCC NO.13929，进行第二阶段初期发酵，然后加入谷氨酸或谷氨酸钠，进行第二阶段后期发酵，当发酵液中GABA含量高于200mg/L时，获得第二发酵液；（4）将所述第二发酵液混匀后，离心、均质及过滤除菌后，制得含GABA发酵酒。

【技术特征摘要】
1.一种利用耐乙醇片球菌生产含GABA发酵酒的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）以新鲜芦笋、山楂等果蔬为原料，洗净、加水破碎，转移至发酵罐中匀浆，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解，获得酶解液后灭菌；（2）接种酿酒酵母CICC1001进行第一阶段发酵，当乙醇浓度达到4%以上时，获得第一发酵液；（3）向第一发酵液接入耐乙醇片球菌CGMCCNO.13929，进行第二阶段初期发酵，然后加入谷氨酸或谷氨酸钠，进行第二阶段后期发酵，当发酵液中GABA含量高于200mg/L时，获得第二发酵液；（4）将所述第二发酵液混匀后，离心、均质及过滤除菌后，制得含GABA发酵酒。2.根据权利要求1所述的含GAB...

【专利技术属性】
技术研发人员：程池，陈建国，史晓萌，张奇，梁寒峭，刘洋，李生有，
申请(专利权)人：中国食品发酵工业研究院，承德先农科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11