一种重组人IL‑24蛋白的PEG修饰方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人IL‑24蛋白(rhIL‑24)的PEG修饰方法,包括：a.构建人IL‑24的重组原核表达载体，诱导表达，得到包涵体；b.选择变性剂对所述包涵体进行变性，得到变性后的蛋白；c.确定复性条件，对所述变性后的蛋白进行复性，得到复性后的蛋白；d.在对所述复性后的蛋白添加SDS的条件下，进行凝胶过滤纯化，得到纯化后的目的蛋白；e.对所述纯化后的目的蛋白用PEG修饰剂进行定点修饰，得到终产品。该方法在制备高纯度重组人IL‑24蛋白的基础上，利用聚乙二醇进行定点修饰，在修饰蛋白的周围产生空间屏障，减少蛋白的酶解，延长了半衰期，且不影响其体外抑瘤活性，利用率增加，提高了稳定性和生物学活性。

PEG modified method of recombinant human IL protein 24

The invention discloses a recombinant human IL protein 24 (rhIL 24) including PEG modified method: A. construction of IL 24 Recombinant Prokaryotic expression vector induced expression, obtained inclusion; B. selection of the denaturant denaturation of inclusion body, get the denatured protein; C. set the renaturation conditions of the denatured protein refolding, the refolded protein; D. SDS is added in the refolded protein under the conditions of gel filtration and purification, get the purified target protein; e. of the purified target protein with PEG modifier site directed modification, to obtain the final product. Based on the method of preparing high purity recombinant human IL protein in 24 system, fixed-point modified by polyethylene glycol, space barriers around modified proteins, decreased protein enzymolysis, prolonged half-life, and does not affect its antitumor activity in vitro, the utilization rate of increase, improve the stability and biological activity.

【技术实现步骤摘要】
一种重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法
本专利技术涉及肿瘤生物治疗
，特别是涉及一种重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法。
技术介绍
人白细胞介素24(Interleukin24,IL-24)是1995年哥伦比亚大学PaulFisher教授通过消减杂交在人黑色素瘤细胞HO-1中发现的一种细胞因子，属于IL-10超家族成员。近二十年的研究表明IL-24是抗肿瘤的“明星”分子。首先，IL-24在正常组织的内源性表达具有高度的组织特异性，只在免疫系统相关组织(如脾、胸腺和外周血白细胞)和特定类型的细胞中表达；其次，IL-24具有广谱而特异的抗瘤活性，能够抑制多种肿瘤(如肺癌、乳腺癌、宫颈癌等)的体内外生长，对正常细胞几乎没有影响，与p53基因型的改变无关；同时，IL-24具有刺激机体抗肿瘤免疫反应的能力，能够诱导外周血单核细胞PBMC产生IL-6、肿瘤坏死因子(TNF-α，IFN-γ)等；而且，IL-24可以增强肿瘤细胞的放化疗敏感性，与肿瘤靶向药物(如厄洛替尼等)、化疗药物(如顺铂等)或放疗联用可产生叠加或协同的抗瘤效果；最后，IL-24在一些肿瘤组织(如黑色素瘤)的高水平表达与预后正相关，提示它可能是一个新的肿瘤预后标志物。正是因为上述这些的特点，IL-24被称为肿瘤治疗的“神奇子弹”，对IL-24进行深入研究不仅具有重要的理论意义，而且具有重大的临床应用价值。在将IL-24应用于临床肿瘤的研究中，美国IntrogenTherapeutics公司于2002年率先开发了携带IL-24基因的重组腺病毒--“INGN241”，Ⅰ期临床实验结果显示对乳腺癌、肺癌和结肠癌的治疗效果良好。与腺病毒载体相比，基因工程蛋白药物更为安全，同时还具有药理活性高、副作用小、用量少、生物活性强、疗效好等特点。当然，在蛋白质多肽类药物的临床使用过程中也存在一些问题，如易被蛋白水解酶水解、较短的循环半衰期、需要频繁注射、较短的保存有效期、易被机体快速清除和易于引起中和抗体的产生等。因此，需求一种方法可以提高其稳定性。
技术实现思路
重组人IL-24蛋白在哺乳动物体系中表达水平极低，但体内外的抑瘤活性高，终浓度为ng/ml，而在大肠杆菌中表达水平高，但活性较低，终浓度为ug/ml，甚至没有活性。考虑到聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)没有免疫原性，亲水性强，在水溶液中有较大的水动力学体积，与蛋白质的某些氨基酸结合后，在修饰蛋白质的周围产生空间屏障，减少蛋白的酶解，避免在机体代谢中被快速清除，同时考虑到PEG是经美国食品药品监督管理局批准的极少数能作为体内注射用药的合成聚合物之一，本专利技术的申请人提出一种重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，来提高大肠杆菌中表达的重组人IL-24蛋白的活性，提高稳定性，延长其半衰期。本专利技术目的在于，克服大肠杆菌表达的重组人IL-24蛋白由于缺乏糖基化修饰等原因导致活性较低的缺陷。本专利技术在制备高纯度重组人IL-24蛋白的基础上，利用聚乙二醇对大肠杆菌表达的重组人IL-24蛋白进行定点修饰，来提高抑瘤活性，提高稳定性，延长半衰期。本专利技术的一个方面，提供一种重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：a.构建人IL-24的重组原核表达载体，诱导表达，得到包涵体；b.选择变性剂，对所述包涵体进行变性，得到变性后的蛋白；c.确定复性条件，对所述变性后的蛋白进行复性，得到复性后的蛋白；d.对所述复性后的蛋白进行凝胶过滤纯化，得到纯化后的目的蛋白；e.对所述纯化后的目的蛋白用PEG修饰剂进行定点修饰，得到终产品。本专利技术所述的IL-24重组蛋白的PEG修饰方法的步骤，其中，步骤a中，首先，选取模板，进行PCR扩增，得到成熟蛋白基因序列，将成熟蛋白基因序列克隆至载体，得到人IL-24的重组原核表达载体，然后，确认诱导条件，优化表达条件，进行诱导表达，得到包涵体。其中，所述确定诱导条件包括选择宿主菌，确定起始菌浓度，确定诱导剂及诱导剂终浓度，确定诱导温度以及诱导时间。优选地，所述模板为IL-24-Flag质粒；所述载体为pET-28a载体。优选地，所述宿主菌为大肠杆菌BL21。优选地，所述起始菌浓度OD600值的范围为0.6～0.8。优选地，所述诱导剂为IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂)。优选地，所述诱导剂的终浓度范围为0.5mM～1mM。优选地，所述诱导时间范围为4～5h。更优选地，所述诱导菌起始浓度OD600值为0.6，所述诱导剂终浓度为0.5mM，所述诱导温度为37℃，所述诱导时间为5h。步骤b，变性前，洗涤所述包涵体，超声碎菌后加入洗涤液对包涵体进行离心洗涤，提高包涵体的纯度；选择变性剂，按照比例加入包涵体和变性剂进行变性，震荡过夜，得到变性后的蛋白。优选地，所述洗涤液包括TritonX-100、NaCl、蒸馏水以及脲。优选地，所述变性剂包括盐酸胍和脲，高浓度的脲和盐酸胍的水溶液能断裂氢键，从而使蛋白质发生不同程度的变性，同时，还可以通过增大疏水基酸性残基在水相中的溶解度，降低疏水相互作用；更优选地，所述变性剂为盐酸胍，重组人IL-24蛋白成熟蛋白疏水性极强，包涵体主要为疏水性聚集，盐酸胍对于疏水性聚集的溶解更好。优选地，所述包涵体与变性剂比例范围为1g：10ml～1g：30ml；更优选地，所述包涵体与变性剂比例为1g：20ml。优选地，所述变性剂在β-疏基乙醇还原二硫键的存在下，配制变性缓冲溶液进行变性。更优选地，所述β-疏基乙醇含量为所述变性缓冲液的1％。步骤c，首先分析重组人IL-24蛋白等电点，进行等电点的模拟确定复性条件：确定复性液pH、氧化还原对及氧化还原对比例、以及复性添加剂；然后对步骤b得到的所述变性后的蛋白进行复性，得到复性后的蛋白。优选地，在酸性条件下进行复性，pH越低，复性效果越好；更优选地，所述复性液pH值为5.5。优选地，所述氧化还原对为谷胱甘肽(GSH-GSSG)；更优选地，所述氧化还原对比例为1:1左右，二硫键正确配对率高。优选地，所述复性添加剂为精氨酸、脲、盐酸胍和甘油；更优选地，所述复性添加剂为脲，脲溶于水后不会电离出离子，助溶效果好。优选地，所述复性添加剂浓度范围为0.5M～3M；更优选地，所述复性添加剂为浓度为2M。步骤d，在步骤c得到的所述复性后的蛋白中，添加表面活性剂，然后采用凝胶过滤柱进行一步凝胶过滤纯化，得到纯化后的目的蛋白，再脱盐除去SDS得到纯度较高的复性蛋白。优选地，所述凝胶过滤柱为GE公司的生产的S200/75。优选地，所述表面活性剂为阴离子表面活性剂，更优选地，所述表面活性剂为高级脂肪醇硫酸酯类，特别优选地，SDS(十二烷基硫酸钠溶液)表面活性剂，重组人IL-24蛋白具有疏水性极强，容易与纯化所用的介质相互作用以及对高盐及其敏感。步骤e中，所述定点修饰包括：确定PEG修饰剂的修饰条件，选择PEG修饰剂，确定PEG与蛋白质摩尔数比例，对步骤d得到的所述纯化后的目的蛋白进行定点修饰，混匀，加入氰基硼氢化钠，混匀静置，得到终产品。优选地，所述PEG修饰剂的修饰条件为酸性条件。优选地，所述PEG修饰剂为醛基修饰剂，更优选地，所述PEG修饰剂为mPEG-ALD(甲氧基聚乙二醇-丙醛)。优选地，优选分子量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人IL‑24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：a.构建人IL‑24的重组原核表达载体，诱导表达，得到包涵体；b.选择变性剂，对所述包涵体进行变性，得到变性后的蛋白；c.确定复性条件，对所述变性后的蛋白进行复性，得到复性后的蛋白；d.对所述复性后的蛋白凝胶过滤纯化，得到纯化后的目的蛋白；e.对所述纯化后的目的蛋白用PEG修饰剂进行定点修饰，得到终产品。

【技术特征摘要】
1.一种重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：a.构建人IL-24的重组原核表达载体，诱导表达，得到包涵体；b.选择变性剂，对所述包涵体进行变性，得到变性后的蛋白；c.确定复性条件，对所述变性后的蛋白进行复性，得到复性后的蛋白；d.对所述复性后的蛋白凝胶过滤纯化，得到纯化后的目的蛋白；e.对所述纯化后的目的蛋白用PEG修饰剂进行定点修饰，得到终产品。2.根据权利要求1所述的重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，步骤a中，所述诱导表达包括诱导条件的确认，所述诱导条件包括选择宿主菌，确定起始菌浓度，确定诱导剂及诱导剂终浓度，确定诱导温度以及诱导时间。3.根据权利要求1所述的重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，步骤b中，所述变性剂为盐酸胍。4.根据权利要求1所述的重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：江红，马群风，郑晓飞，张耀，王俊峰，张驰，史亦南，葛建林，化计磊，
申请(专利权)人：北京交通大学，
类型：发明
国别省市：北京,11