一种具有α‑糖苷酶抑制活性的丝胶肽及其制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有α‑糖苷酶抑制活性的丝胶肽，丝胶肽的序列如SEQ ID No:1所示；同时本发明专利技术还涉及一种具有α‑糖苷酶抑制活性的丝胶肽的合成制备及其生物学活性的应用。本发明专利技术提供的丝胶肽对开发具有降餐后血糖的食品、保健品与药品以及开发治疗2型糖尿病的食品、保健品与药品具有重要意义。

The preparation and application of a with alpha glycosidase inhibitory activity of sericin peptide and its preparation

The invention discloses a alpha glycosidase inhibitory activity of sericin peptides, sequence of sericin peptides is shown as SEQ ID No:1; at the same time, the invention also relates to a alpha glycosidase inhibitory activity of sericin peptide synthesis and biological activity of the application. The sericin peptide provided by the invention has great significance for developing food, health care product and medicine, and developing food, health care product and medicine for treating type 2 diabetes.

【技术实现步骤摘要】
一种具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽及其制备与应用
本专利技术涉及生物技术多肽制备领域，尤其涉及一种具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽及其制备与应用。
技术介绍
生物活性肽作为促进健康的生物活性成分，具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，是当前国际食品界热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。各种活性肽常作为功能食品添加成分用于食品或药品的实践生产，特别是在乳饮料、食品添加剂、保健食品的应用方面已经取得良好效果。近年来，随着人们生活水平的提高，糖尿病的发生率正呈现逐年上升的趋势。其中，2型糖尿病是糖尿病的主要形式，主要症状是餐后血糖含量较高。在现代医学实践中，为了控制糖尿病的进一步恶化，也主要以控制餐后血糖含量为主。α-糖苷酶是位于小肠用于将碳化合物分解为葡萄糖的酶，因此使得血糖含量升高。通过抑制α-糖苷酶的活性，使得淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低了餐后高血糖，以达到治疗糖尿病的目的。目前在临床上应用的α-糖苷酶抑制剂类降糖药主要有阿卡波糖和伏格列波糖，用于降低餐后血糖含量。但是，阿卡波糖和伏格列波糖都会引起一定程度的腹胀排气等胃肠反应，同时长期服用的话会引起肝脏损伤。丝胶蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70％～80％。随着医学生物技术的发展，丝胶蛋白，尤其是丝胶蛋白或丝胶肽，已经被广泛的用于新型功能性材料。丝胶肽加到食品中，有显著的抗氧化功效；同时，丝胶肽的降血脂、降血压、降血糖、防止血栓和凝血及增强肌肉能量等功能已被广泛报道。根据目前的研究进展可以发现丝胶肽在抗氧化、降血糖、降血压方面有极大的应用价值，因此丝胶肽及其具有相同生物活性的衍生多肽大批量生产制备技术成为健食品和生物医药重点研发方向。因此，本领域的技术人员致力于开发一种具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽及其制备与应用。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽及其制备与应用。为实现上述目的，本专利技术的第一个方面提供了一种具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽。在一个优选的实施例中，该具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽包括如下序列(SEQIDNo:1)：SEDSSEVDIDLGN，即SerGluAspSerSerGluValAspIleAspLeuGlyAsn。可选地，上述丝胶肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化修饰。进一步地，上述具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽来源为丝胶蛋白。进一步地，上述具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽来源于丝胶蛋白(Protein:Sericin1,Organism:Bombyxmori(Silkmoth))，并且为丝胶蛋白(SEQIDNO:2)第490～502位的氨基酸残基。进一步地，上述具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽具有体外α-糖苷酶抑制活性。进一步地，上述具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽可以通过基因工程的方法和化学方法人工合成，也可以从蚕丝中通过分离纯化、酶降解的方法获得。本专利技术的第二方面提供了上述丝胶肽的制备方法。在一个优选的实施例中，该制备方法的步骤如下：(1)称取n当量的氨基树脂放入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀，然后抽掉DCM，以活化待用；(2)连接第一个氨基酸：加入序列中2n当量的第一个氨基酸，加入DCM，二甲基甲酰胺(DMF)以及2n当量的二异丙基乙胺(DIEA)，氮气鼓泡反应。然后加入甲醇，反应30min，抽掉反应液，用DMF和甲醇洗净；(3)缩合反应：往反应器中加入序列中2n当量的第二个氨基酸，2n当量的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)及DIEA，氮气鼓泡反应后洗掉液体，茚三酮检测；(4)封闭反应：加入吡啶和乙酸酐进行封端，洗净；(5)脱Fmoc保护基：加入脱帽液，脱帽液为含20％六氢吡啶的DFM溶液)，脱帽反应后脱去Fmoc保护基团，然后洗净，茚三酮检测；(6)依步骤(3)、(4)和(5)依次加入序列中不同的氨基酸并进行磷酸化修饰；(7)加入切割液裂解多肽，震荡后滤掉树脂；(8)向滤液中加入乙醚，析出粗产物，离心清洗后得到序列的粗产物；(9)用高效液相色谱技术将粗产品提纯；(10)当肽纯度达到99％以上后，进行二次制备纯化，在水和乙腈中分别加入千分之一的磷酸，用以去除合成过程中残留的三氟乙酸等杂质，在磷酸盐体系中有效提高了合成肽的生物活性，从柱子中洗脱出多肽后冻干。优选地，步骤(1)中氨基树脂采用DCM溶胀活化，溶胀时间为30min。优选地，步骤(2)中DCM和DMF加入量，以使树脂可以充分鼓动起来为宜。优选地，步骤(2)中鼓泡反应时间为60min。优选地，步骤(5)中脱帽反应时间为30min。优选地，步骤(6)中依次加入序列中不同的氨基酸后可以进行多种形式的修饰，从而改变合成的丝胶肽的蛋白质空间构象，进而改变其生物学活性。优选地，步骤(7)中所述切割液的组分体积比为三氟乙酸(TFA)：乙二硫醇：三异丙基硅烷(TIS)：H2O＝95:2:2:1；所述的切割时间为1-4h。优选地，步骤9)中高效液相技术采用Kromasil100-5C18柱；流动相A、B分别为0.1％TFA水溶液和0.1％TFA的乙腈溶液；进样量为10μL；进行15％-48％B相得梯度洗脱。本专利技术的第三个方面提供了上述丝胶肽的应用。上述应用为在制备α-糖苷酶活性或降餐后血糖的食品、保健品及药品中的应用。本专利技术的第四个方面提供了一种抑制α-糖苷酶活性的生物活性物质，其包括如上所述的具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽。该抑制α-糖苷酶活性的药物可以是餐后降血糖药物。本专利技术提供的具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽具有良好的抑制α-糖苷酶活性，IC50能达到0.39mg/mL，可以达到降低餐后血糖的效果，对开发具有治疗2型糖尿病的食品、保健品和药品具有十分重要的意义和应用价值。以下将结合附图对本专利技术的构思及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1是合成多肽的HPLC洗脱图谱；图2是合成多肽的ESI-MS图谱；图3是合成多肽对α-糖苷酶抑制的相对活性。具体实施方式在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下属特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本专利技术的记载，还可以使用于本专利技术实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本专利技术。除非另外说明，本专利技术中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
常规的分子生物学、生物化学、分析化学及相关领域的常规技术。实施例1一种具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽制备：其中，具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽具有如SEQIDNo:1所示的氨基酸序列。其制备步骤如下：(1)称取n当量树脂放入反应器，加入DCM溶胀半小时，然后抽本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有α‑糖苷酶抑制活性的丝胶肽，其特征在于，所述的具有α‑糖苷酶抑制活性的丝胶肽的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽，其特征在于，所述的具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示。2.一种如权利要求1所述的具有α-糖苷酶抑制活性的丝胶肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)称取n当量的氨基树脂放入反应器，加入二氯甲烷溶胀，然后抽掉二氯甲烷，活化待用；2)连接第一个氨基酸：加入2n当量的序列中第一个氨基酸，加入二氯甲烷、二甲基甲酰胺以及2n当量的二异丙基乙胺，氮气鼓泡反应，然后加入甲醇，反应30min，抽掉反应液，用二甲基甲酰胺和甲醇洗净；3)缩合反应：往反应器中加入序列中第二个氨基酸，2n当量的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐及二异丙基乙胺，氮气鼓泡反应后洗掉液体，茚三酮检测；4)封闭反应：加入吡啶和乙酸酐进行封端，洗净；5)脱Fmoc保护基：加入脱帽液，脱帽液为含20％六氢吡啶的二甲基甲酰胺溶液，脱帽反应后脱去Fmoc保护基团，然后洗净，茚三酮检测；6)依步骤3)、4)和5)依次加入序列中不同的氨基酸；7)加入切割液裂解多肽，震荡后滤掉树脂；8)向滤液中加入乙醚，析出粗产物，离心清洗后得到序列的粗产物；9)用高效液相色谱技术将粗产品提纯；10)二次制备纯化，当肽纯度超过99％，在水和乙腈中分别加入千分之一的磷酸，从柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴金鸿，杨迎，马鸿承，陈姗姗，张莉，罗静，王正武，龚盛祥，张维，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31