重组灵芝免疫调节蛋白突变体及其应用制造技术

重组灵芝免疫调节蛋白突变体及其应用。本发明专利技术是在发现rLZ‑8蛋白结构中所存在的抗‑EGFR结构区域，特别是该结构区域通过其正电势特征诱导一种对EGFR异常表达肿瘤的杀伤作用。在以上科学发现的基础上，利用计算机模拟技术获得了具有更强抗肿瘤作用的rLZ‑8突变体蛋白。

Recombinant Ganoderma lucidum immunomodulatory protein mutant and uses thereof

Recombinant Ganoderma lucidum immunomodulatory protein mutant and uses thereof. The present invention is found in anti domains of EGFR rLZ which is 8 protein structure, especially the structure of regional characteristics through its positive potential for EGFR induced abnormal expression of tumor killing effect. On the basis of scientific discovery, the antitumor effect of stronger rLZ 8 mutant proteins using computer simulation techniques.

【技术实现步骤摘要】
重组灵芝免疫调节蛋白突变体及其应用
在本专利技术
包括计算机模拟技术对蛋白质的突变所进行的优化和改造。
技术介绍
人表皮生长因子受体（EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR）分子量为170kDa的跨膜受体，其由原癌基因编码，并且显示固有的酪氨酸激酶活。表皮生长因子（EGF），转化生长因子-α（TGF-α），双调蛋白，肝素结合EGF和β动物纤维素等均为与EGFR结合的配体。EGFR经配体激活后，经由酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节许多细胞过程，包括但不限于激活控制细胞增殖、分化、细胞存活、程序性细胞死亡等。已有大量研究表明，EGFR虽然在正常组织的细胞中表达，但表达量很低，而在许多癌症细胞表面的EGFR异常过量表达，包括肺癌、乳腺癌、直肠结肠癌等。针对EGFR表达过量后，其经由配体激活引发了癌细胞增殖分化这一现象特点，目前已上市的小分子和抗体药物是针对靶向EGFR胞外部分的EGF结合位点或胞内部分的酪氨酸激酶活性位点。小分子酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼和厄洛替尼能够阻断EGFR的自磷酸化，抑制下游信号的传导。另一方面，单克隆抗体，靶向EGFR的胞外部分，阻断配体结合并由此抑制下游通路的激活如细胞增殖。抗体所引发的EGFR内化正逐渐被本领域研究者关注。对于EGFR内化的研究为以EGFR为靶点的生物药提供了新的开发策略。从上世纪开始，EGFR的内化行为得到了广泛研究。EGFR的内吞主要有网格蛋白依赖和网格蛋白非依赖两种方式，当低浓度EGF作用时，EGFR以网格蛋白介导的方式内吞；当使用高浓度EGF时，EGFR主要以非网格蛋白方式内吞，包括小窝和巨胞饮。就内吞机制来说，近年争论焦点在于内吞是否依赖于EGFR的二聚化，激酶活性，氨基酸位点的磷酸化，泛素化，以及碳端的模体（motif）。当同时使用两种抗EGFR第三结构域抗体时，EGFR不形成活性二聚体，络氨酸位点无明显磷酸化，这与使用单种抗体时，EGFR发生的现象是一致的。索尔金等人认为,不论高低剂量的EGF作用，EGFR的内吞与EGFR的激酶活性、主要的络氨酸位点的磷酸化有很大程度的相关性。可见，若依赖磷酸化机制入胞，抗体的内吞现象并不能得以解释。皮埃尔等人认为，高浓度EGF作用时，EGFR的泛素化修饰能促进其内吞。泛素化是否能促进EGFR的内吞，存在广泛争议，低浓度EGF作用时，EGFR以网格蛋白方式内吞，泛素化程度低，并不依赖于泛素化；但当EGFR胞内域全切除时，融合于EGFR末端的单个泛素分子确能帮助EGFR以小窝的方式入胞。YosefYarden的数据表明，当使用两种抗体作用于EGFR时，EGFR能发生泛素化修饰，但泛素化在抗体作用的EGFR内吞机制中扮演的角色尚不清楚。ZhixiangWang等人认为，EGFR的入胞并不依赖于EGFR激酶活性，主要赖氨酸的磷酸化修饰，以及EGFR胞内域碳末端的大部分区域。但这种机制依然不能解释抗体的内吞行为，YosefYarden等在2004年时指出，同时使用抗Her-2的赫赛汀和L26单抗时，EGFR的内化不依赖于EGFR的胞内域，甚至是跨膜区。PaulM.P.vanBergenenHenegouwen等人在研究抗EGFR的具有非重叠表位的双特异性抗体分子内吞机制时发现，EGFR以网格蛋白方式内吞，即使切除EGFR的胞内域部分，EGFR仍然发生大量内化，内化量甚至超过胞内域完整的EGFR，但其指出，EGFR的跨膜区N端的二聚化对于完整的EGFR的内化十分重要。因此，当抗体与EGFR作用时，EGFR的入胞行为难以用EGF作用时EGFR的入胞模式来解释。我们认为，抗体作用时，EGFR的内吞机制与其特殊的内吞方式有关。EspenStang等人发现，共同使用Cetuximab以及抗Cetuximab的IGg抗体，EGFR以巨胞饮的方式发生大量内吞，不依赖磷酸化，而依赖肌动蛋白的聚合。YosefYarden等人猜测，这种入胞行为与抗体在细胞表面形成的抗体-受体复合物大小相关。当使用抗体对时，由于表位的非重叠性，使得大量的EGFR得以被动聚集，从而在细胞膜上形成巨大分子量的抗体-受体复合物，这是单独使用一种抗体或者使用两种表位竞争的抗体所不能引起的。有质谱实验数据表明，具有两个非重叠表位的抗HER-2双特异性抗体，能在细胞膜上形成1716KDa的复合物。这在一定程度上证实了以上猜测，但促使EGFR以巨胞饮方式入胞的机制并不清楚，且这种入胞方式伴随受体的大量降解。有文献表明，网格蛋白除了参与内吞，还能促进内吞体胞内循环，且以不依赖泛素化的机制进行降解；而以巨胞饮方式内吞，能极大提高内吞效率以及降解效率。高浓度EGF作用下，EGFR依然可以发生巨胞饮，并且可以促进EGFR在膜上发生聚集，形成EGFR聚合体。与使用两种非竞争抗体促进EGFR聚合形成复合物所不同的是，EGF作用下，EGFR的聚集是一种主动的依赖于磷酸化以及肌动蛋白聚集的行为。我们认为，当两种抗体共同使用时，在EGFR发生被动聚集的过程中，引起了细胞膜的局部流动，微丝的重聚，促进EGFR以巨胞饮的方式入胞，这是不依赖于胞内域的模体以及EGFR胞内域修饰的入胞行为。以上的研究都是针对免疫球蛋白结构的抗体进行的内吞以及其内吞机制的研究。灵芝免疫调节蛋白背景知识及其前期研究。本专利技术中的蛋白药物，由于其蛋白结构与传统的免疫球蛋白抗体完全不同,该蛋白质来源于灵芝免疫蛋白。在1989年，Kino等人从赤灵芝菌丝体提取物中分离纯化得到灵芝免疫调节蛋白（ImmunoregulatoryproteinofGanodermalucidium），并测定其氨基酸顺序和免疫生理活性，命名该蛋白质为Lingzhi-8(LZ-8)。LZ-8由110个氨基酸残基组成，氨基端乙酰化，分子量为12.4KDa，等电点为4.4。但Kino等人提取的天然LZ-8含有1.3%的多糖，我们通过基因工程技术手段，在毕赤酵母中重组表达获得与天然LZ-8氨基酸序列相同、活性相似、纯度高于99%的重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8。而后又通过动物药效学的实验证明了重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）具有抗肿瘤作用（CN101475632）。荷瘤小鼠实验表明，rLZ-8可以抑制小鼠艾氏腹水瘤细胞S180和移植性肝癌细胞H22在体内生长。通过蛋白荧光标记实验表明，其抗肿瘤作用是通过与肿瘤细胞膜特异性结合诱导其凋亡而杀伤或杀死肿瘤细胞。可见，找到rLZ-8自身的抗肿瘤结构域以及在肿瘤细胞上的靶受体将可能为癌症治疗带来新的技术。灵芝免疫调节蛋白的N端是重要的形成的二聚体结构域，C端是一个FNIII结构域。N端由一个α-螺旋（由14个氨基酸组成，氨基酸序列为2-SDTALIFRLAWDVK-15）和一个β-折叠（由5个氨基酸组成，氨基酸序列为16-KLSFD-20），其中在α螺旋上的Ser残基被乙酰化。N端的一个α螺旋和一个β折叠组成了二聚体中的一个单体，与另一个相同单体通过结构域交互，形成哑铃状的二聚体。C端的FNIII结构域属于免疫球蛋白相似的三明治结构。C端由β-平面I和β-平面II组成，其中β-平面I和β-平面II分别由β-折叠A-B-E和β-折叠G-F-C-D构成。计算机分子模拟在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有癌症治疗用途的蛋白质突变体，该突变体序列来自于对重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ‑8）的人为突变，所涉及的突变位置如下所述第6‑9位氨基酸、第16‑20位氨基酸、第41‑46为氨基酸和第68‑74位氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种具有癌症治疗用途的蛋白质突变体，该突变体序列来自于对重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）的人为突变，所涉及的突变位置如下所述第6-9位氨基酸、第16-20位氨基酸、第41-46为氨基酸和第68-74位氨基酸。2.如权利要求1所述突变体，包括在所涉及突变位置的单点突变。3.如权利要求1所述突变体，包括在所涉及突变位置的多点突变。4.如权利要求1所述突变体，其应用通过与EGFR结合，治疗EGFR表达异常的肿瘤以及相关疾病。5.如权利要求1所述突变体，可由以下任意一种基因工程技术所得的重组表达系统获得，包括原核表达系统、真菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统。6.如权利要求1所述突变体，其应用包括单独应用以及与其他药物联用。7.如权利要求1所述突变体，其应用包括作为制备各种药剂剂型的主要活性物质进行体外各种途径的给药。8.如权利要求1所述突变体，其应用包括其任何剂量，以及与其他药物的任何剂量的联用。9.如权利要求4所述治疗EGFR表达异常的肿瘤以及相关疾病，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙非，梁重阳，
申请(专利权)人：张喜田，孙非，
类型：发明
国别省市：吉林,22