甜菊醇糖苷的微生物产生制造技术

本发明专利技术提供了用于制备甜菊醇糖苷(包括RebM和作为甜叶菊叶中的次要产物的糖基化产物)的方法，并提供了用于这些方法的酶、编码多核苷酸和宿主细胞。本发明专利技术提供了用于以高纯度和/或产率产生甜菊醇糖基化产物诸如RebM的工程化的酶和工程化的宿主细胞。本发明专利技术还提供了制备含有甜菊醇糖苷诸如RebM的产品的方法，所述产品包括食品、饮料、口腔护理产品、甜味剂和调味品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】甜菊醇糖苷的微生物产生相关申请本申请要求2014年11月5日提交的美国临时申请第62/075,644号的优先权和权益，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。
本公开涉及酶(包括工程化的酶)、编码多核苷酸、宿主细胞和用于产生甜菊醇糖苷的方法。
技术介绍
高强度甜味剂具有比蔗糖甜味水平高许多倍的甜味水平。它们基本上是无热量的，并且通常用于饮食和低热量产品，包括食品和饮料。高强度甜味剂不引起升糖反应，这使其适用于针对糖尿病患者的产品和意在控制碳水化合物摄入量的其它产品。甜菊醇糖苷是在甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)(原产南美某些地区的菊科(Asteraceae)(菊科(Compositae))家族的多年生灌木)的叶中发现的一类化合物。它们的结构特征在于差异在于碳水化合物残基在C13位和C19位存在单一碱基甜菊醇。它们在甜叶菊叶中积累，占总干重的约10％至20％。基于干重，甜叶菊叶中发现的四种主要糖苷通常包括甜菊苷(9.1％)、莱鲍迪苷A(3.8％)、莱鲍迪苷C(0.6-1.0％)和杜尔可苷A(0.3％)。其它已知的甜菊醇糖苷包括莱鲍迪苷B、C、D、E、F和M、甜菊双糖苷和甜茶苷。估计次要糖基化产物莱鲍迪苷M的效力为蔗糖的约200-350倍，并且被描述为具有稍微苦味或甘草回味的甘醇味道。PrakashI等，DevelopmentofNextGenerationSteviaSweetener:RebaudiosideM,Foods3(1),162-175(2014)。RebM对全球食品行业具有重大意义。虽然已知用于从甜叶菊制备甜菊醇糖苷的方法，但是许多这类方法不适合在商业上使用和/或不可持续。因此，仍然需要用于制备包含甜菊醇糖苷的组合物(包括高度纯化的甜菊醇糖苷组合物)的简单、高效和经济的方法。另外，需要用于产生大量次要糖基化产物(包括具有多个糖基化的产物诸如RebA、RebD、RebE、RebI、RebM等)的方法。专利技术概述在各个方面，本专利技术提供了制备甜菊醇糖苷(包括RebD和RebM以及作为甜叶菊叶中次要产物的糖基化产物)的方法，并提供用于这些方法的酶、编码多核苷酸和宿主细胞。本专利技术提供了用于以高纯度和/或产率产生甜菊醇糖基化产物诸如RebD和RebM的工程化的酶和工程化的宿主细胞。本专利技术还提供了制备含有甜菊醇糖苷的产品的方法，其中所述产品包括食品、饮料、口腔护理产品、甜味剂和调味品。在各个方面和实施方案中，本专利技术提供了用于产生在C13和/或C19处具有多个糖基化的甜菊醇糖苷的酶、编码多核苷酸、宿主细胞和方法。甜菊醇糖苷可具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个糖基化。在各种实施方案中，糖基化选自：C13-O、C19-O、1-2'(在甜菊醇的C-13和/或C19处)和1-3’(在甜菊醇的C13和/或C19处)。进行这些糖基化的示例性酶列于表8中，包括催化甜菊醇的C13-O糖基化(例如，SrUGT85C2)、甜菊醇的C19-O糖基化(例如，SrUGT74G1)、甜菊醇糖苷的1-2’糖基化(例如，SrUGT91D1、SrUGT91D2、OsUGT1-2)和甜菊醇糖苷的1-3’糖基化(例如，SrUGT76G1)的酶。本文公开了可用于各种实施方案的许多衍生物，包括在本文中被鉴定为MbUGTc13(SEQIDNO:51)、MbUGTc19(SEQIDNO:8)、MbUGTc19-2(SEQIDNO:46)、MbUGT1-2(SEQIDNO:9)、MbUGT1,2-2(SEQIDNO:45)和MbUGT1-3(SEQIDNO:10)及其衍生物的酶。在一些实施方案中，本专利技术提供子了表达用于在体内对菊糖醇底物进行这些糖基化的至少2种、3种或4种UGT酶的宿主细胞。可根据本专利技术的实施方案可产生的各种甜菊醇糖苷产物示于图28-31和表10中，这些产物包括RebM、RebD、RebE和RebI。根据本专利技术的实施方案，这些甜菊醇糖苷可在细菌宿主细胞诸如大肠杆菌(E.coli)中(包括在适于大肠杆菌生长和代谢的温度下)以高产率产生。在一些方面，本专利技术提供了与其亲本UGT酶相比在莱鲍迪苷A(RebA)的C19处具有1-2'糖基化活性的增加，而在甜菊醇糖苷的C13处没有1-2’糖基化活性的显著损失的经修饰的UGT酶。此类酶可以提供至RebD的增加的碳通量。另外，本专利技术提供了与其亲本UGT酶相比，在莱鲍迪苷D(RebD)的C19处具有1-3’糖基化活性的增加，而在甜菊醇糖苷的C13处没有1-3’糖基化活性的显著损失的经修饰的UGT酶。此类酶可提供至RebM的增加的碳通量。根据本公开，通过产生从糖酵解至甜菊醇再到甜菊醇糖苷的各种途径模块在宿主细胞中工程化甜菊醇糖苷的产生，并且可优化和平衡所述途径模块以促进至甜菊醇，然后至RebD或RebM(或其它糖基化产物)(作为主要糖基化产物)的碳通量。在另一个方面，本专利技术提供了制备RebD的方法。该方法包括提供通过多种尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶酶(UGT)从甜菊醇产生RebD的宿主细胞，以及在产生RebD的条件下培养所述宿主细胞。UGT酶包含与其亲本UGT酶相比在莱鲍迪苷A(RebA)的C19处具有1-2'糖基化活性的增加，而在甜菊醇糖苷的C13处没有1-2'糖基化活性的显著损失的经修饰的UGT酶。在某些实施方案中，莱鲍迪苷A(RebA)的C19处的1-2'糖基化活性等于或优于甜菊醇糖苷的C13处的1-2'糖基化活性。在另一个方面，本专利技术提供了制备RebM的方法。该方法包括提供通过多种尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶酶(UGT)从甜菊醇产生RebM的宿主细胞，以及在产生RebM的条件下培养所述宿主细胞。UGT酶包括以下酶的一种或多种：(a)与其亲本UGT酶相比，在莱鲍迪苷A(RebA)的C19处具有1-2’糖基化活性的增加，而在1-2’甜菊醇糖苷的C13处没有1-2’糖基化活性的显著损失的经修饰的UGT酶；和(b)与其亲本UGT酶相比，在莱鲍迪苷D(RebD)的C19处具有1-3’糖基化活性的增加，而在甜菊醇糖苷的C13处没有1-3’糖基化活性的显著损失的经修饰的UGT酶。在某些实施方案中，莱鲍迪苷A(RebA)的C19处的1-2’糖基化活性等于或优于甜菊醇糖苷的C13处的1-2’糖基化活性。可选地或另外地，莱鲍迪苷D(RebD)的C19处的1-3’糖基化活性等于或优于甜菊醇糖苷的C13处的1-3'糖基化活性。在一些实施方案中，本专利技术提供了经修饰的SrUGT76G1酶，其提供甜菊醇糖苷和RebD的1-3’糖基化活性，包括在野生型酶(例如，L200A或L200G)的位置200处具有氨基酸取代的酶，其表现出活性的显著提高。在其它方面和实施方案中，本专利技术提供了UGT酶(以及编码多核苷酸)的环状重排体，其可提供相对于野生型酶新型的底物特异性、产物特征谱和反应动力学。如本文所述，可在宿主细胞中表达环状重排体以产生甜菊醇糖苷。因此，在各种实施方案中，微生物细胞表达至少一种为野生型或亲本UGT酶的环状重排体的UGT酶。一个环状重排体保留了亲本酶的相同基本折叠，但具有不同的N-末端位置(例如，“切割位点”)，原始的N-和C-末端任选地通过连接序列连接。例如，在环状重排体中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备莱鲍迪苷M(RebM)或莱鲍迪苷D(RebD)的方法，所述方法包括：提供通过多种尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶酶(UGT)从甜菊醇产生RebM或RebD的宿主细胞，所述UGT酶包含以下的一种或多种：(a)与其亲本UGT酶相比，在莱鲍迪苷A(RebA)的C19处具有1‑2’糖基化活性的增加，而在甜菊单苷的C13处没有1‑2’糖基化活性的显著损失的经修饰的UGT酶；和(b)与其亲本UGT酶相比，在莱鲍迪苷D(RebD)的C19处具有1‑3’糖基化活性的增加，而在甜菊苷的C13处没有1‑3’糖基化活性的显著损失的经修饰的UGT酶；以及在用于产生所述RebM的条件下培养所述宿主细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.05 US 62/075,6441.一种制备莱鲍迪苷M(RebM)或莱鲍迪苷D(RebD)的方法，所述方法包括：提供通过多种尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶酶(UGT)从甜菊醇产生RebM或RebD的宿主细胞，所述UGT酶包含以下的一种或多种：(a)与其亲本UGT酶相比，在莱鲍迪苷A(RebA)的C19处具有1-2’糖基化活性的增加，而在甜菊单苷的C13处没有1-2’糖基化活性的显著损失的经修饰的UGT酶；和(b)与其亲本UGT酶相比，在莱鲍迪苷D(RebD)的C19处具有1-3’糖基化活性的增加，而在甜菊苷的C13处没有1-3’糖基化活性的显著损失的经修饰的UGT酶；以及在用于产生所述RebM的条件下培养所述宿主细胞。2.如权利要求1所述的方法，其中：(a)在莱鲍迪苷A(RebA)的C19处的1-2’糖基化活性等于或优于在甜菊单苷的C13处的1-2’糖基化活性；和/或(b)在莱鲍迪苷D(RebD)的C19处的1-3’糖基化活性等于或优于在甜菊苷的C13处的1-3’糖基化活性。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞只表达一种在甜菊单苷的C13处具有1-2’糖基化活性的UGT酶，和/或只表达一种在甜菊苷的C13处具有1-3’糖基化活性的UGT酶。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中至少一种UGT酶是亲本UGT酶的环状重排体。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述环状重排体在对应于野生型酶的位置150与300的氨基酸之间，和任选地在氨基酸170与280之间以及任选地在残基190与210之间具有切割位点。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述具有1-2’糖基化活性的UGT酶是OsUGT1-2或SrUGT91D2，或SrUGT91D1，或在RebA的C19处具有增加的糖基化活性的其衍生物。7.如权利要求6的方法，其中所述具有1-2’糖基化活性的UGT酶是OsUGT1-2或其衍生物，并且其任选地是包含增加RebA的C19处的1-2’糖基化活性的一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的OsUGT1-2的环状重排体。8.如权利要求7所述的方法，其中所述具有1-2’糖基化活性的UGT酶是OsUGT1-2的环状重排体，所述OsUGT1-2的环状重排体具有对应于SEQIDNO：7的190至210内的位置的切割位点且任选地在对应于SEQIDNO：7的N末端和C末端残基的氨基酸之间具有接头序列，并且其中所述接头任选地具有2个至25个氨基酸的长度。9.如权利要求8所述的方法，其中所述接头的长度为8个至20个氨基酸，以及任选地为17个氨基酸。10.如权利要求6或7所述的方法，其中所述切割位点对应于SEQIDNO：7的位置196、197、198或199。11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述具有1-2’糖基化活性的UGT酶是SrUGT91D2或其衍生物，其任选地为包含增加RebA的C19的糖基化活性的一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失的环状重排体。12.如权利要求10所述的方法，其中所述具有1-2’糖基化活性的UGT酶是MbUGT1,2-2(SEQIDNO:45)或其衍生物。13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述具有1-3’糖基化活性的UGT酶是SrUGT76G1，或在RebD的C19处具有增加的糖基化活性的其衍生物。14.如权利要求13所述的方法，其中所述具有1-3’糖基化活性的UGT酶是SrUGT76G1的衍生物，其是任选地包含增加对RebD的C19的糖基化活性的一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失的环状重排体。15.如权利要求14所述的方法，其中所述具有1-3’糖基化活性的UGT酶是SrUGT76G1的衍生物，其在位置200、284和/或379中的一个或多个位置处包含氨基酸取代，所述氨基酸取代任选地是L200A、L200G、T284G和/或L379G，其中氨基酸位置根据SEQIDNO：3来编号。16.如权利要求14或15所述的方法，其中所述SrUGT76G1是具有对应于SEQIDNO：3的位置190至290内的残基的切割位点的环状重排体。17.如权利要求16所述的方法，其中所述环状重排体具有对应于SEQIDNO：3的位置213、239、255、261或263的切割位点。18.如权利要求17所述的方法，其中所述环状重排体具有对应于SEQIDNO：3的位置263的切割位点且任选地在对应于SEQIDNO:3的N-末端和C-末端残基的氨基酸之间具有接头序列，并且其中所述接头任选地具有2个至25个氨基酸的长度。19.如权利要求18所述的方法，其中所述接头的长度为8个至20个氨基酸。20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞还包含将甜菊醇转化成甜菊单苷的UGT酶。21.如权利要求20所述的方法，其中将甜菊醇转化成甜菊单苷的所述UGT酶是SrUGT85C2或其衍生物。22.如权利要求21所述的方法，其中将甜菊醇转化成甜菊单苷的所述UGT酶是SrUGT85C2衍生物，其包含以下根据野生型序列编号的突变中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个突变：P215T、S308T、D311Q、G316A、H349E、E414G和G420D。23.如权利要求21所述的方法，其中将甜菊醇转化成甜菊单苷的所述酶是SrUGT85C2的环状重排体。24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞还包含将甜菊双糖苷转化成甜菊苷的UGT酶。25.如权利要求24所述的方法，其中将甜菊双糖苷转化成甜菊苷的所述UGT酶是SrUGT74G1或其衍生物。26.如权利要求25所述的方法，其中将甜菊双糖苷转化成甜菊苷的所述酶是SrUGT74G1的环状重排体。27.如权利要求26所述的方法，其中所述SrUGT74G1的环状重排体具有对应于所述野生型酶的位置258、259、260、261或262的切割位点。28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞通过酶促途径产生甜菊醇底物，所述酶促途径包含贝壳杉烯合酶(KS)、贝壳杉烯氧化酶(KO)和贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)，所述宿主细胞还包含细胞色素P450还原酶(CPR)以用于再生KO和KAH酶中的一种或多种。29.如权利要求28所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。30.如权利要求28所述的方法，其中所述KAH是甜叶菊、拟南芥、葡萄或蒺藜苜蓿的KAH或其衍生物。31.如权利要求30所述的方法，其中所述KAH是拟南芥KAH(AtKAH)或其衍生物。32.如权利要求31所述的方法，其中所述AtKAH具有增加贝壳杉烯酸羟化酶活性的速率的一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失，和/或具有经工程化以在大肠杆菌中功能性表达的N末端。33.如权利要求32所述的方法，其中所述AtKAH在对应于SEQIDNO：29的以下位置的一个或多个位置处具有氨基酸取代：25、79、119、137、142、155、180、193、196、197、226、331、235、238、245、272、285、287、325、330、334、339、352、373、397、470、499、506和507，并且其任选地是以下中的一个或多个：A25L、S79T、T119C、I137L、I142V、R155K、M180L、E193G、C196A、D197E、A226E、L235Q、I238M、F245L、F245V、L272I、I285R、C287S、C325I、C325M、F330L、C331I、D334E、S339T、S352E、E373D、I397F、V470L、Q499V、L506M、L507I、L507T和L507V。34.如权利要求33所述的方法，其中所述AtKAH包含在对应于所述野生型序列的位置331的位置处包含氨基酸取代，并且其中所述取代任选地为C331I。35.如权利要求28至34中任一项所述的方法，其中所述KS任选地是来自甜叶菊、玉米、毛果杨或拟南芥的KS或其衍生物。36.如权利要求28至35中任一项所述的方法，其中所述细胞表现达来自甜叶菊、嗜气管欧文氏菌、费氏中华根瘤菌、棒状链霉菌、日本慢生根瘤菌、玉米、拟南芥的柯巴基二磷酸合酶(CPPS)或其衍生物。37.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖安·菲力浦，阿吉库玛·帕拉伊尔·库马兰，詹森·唐纳德，克利须那·帕特尔，斯瓦蒂·古普塔，莱恩·利姆，李立伟，
申请(专利权)人：马努斯生物合成股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US