本发明专利技术提供改进的使用酶和特别设计的核苷酸类似物合成如DNA和RNA的聚核苷酸的方法。使用本发明专利技术方法，特定聚核苷酸序列可以在水溶液环境中在不使用核酸模板下从头一个碱基接一个碱基地合成。因为该等核苷酸类似物具有未经修饰的3'OH，即如“天然”脱氧核苷和核糖分子中所见，所以该等类似物产生适用于并入到生物系统中的天然聚核苷酸。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】合成核酸的方法和设备相关申请本申请要求2014年10月27日提交的美国临时专利申请第62/069,067号和2014年8月18日提交的美国临时专利申请第62/038,604号的优先权及权益。每一以上申请的公开内容均以其全文引用的方式并入本文中。
本专利技术涉及合成具有所需序列的聚核苷酸(从头)且不需要模板的方法和设备。由此，本专利技术能够制造具有变化序列和变化长度的聚核苷酸文库以用于研究、基因工程以及基因疗法。
技术介绍
基因工程需要确定基因材料的含量的工具以及构筑所需基因材料的工具。确定基因材料的含量的工具使得可以在低于$1,000下在约一天内对整个人类基因组测序。(参见生命技术，新闻稿：BenchtopIonProtonTM测序仪，2012年1月10日(LifeTechnologies,PressRelease:BenchtopIonProtonTMSequencer,January10,2012))。相反，构筑所需基因材料(例如从头DNA合成)的工具并未同步改进。作为参照点，在过去的25年，小核酸从头合成的成本(每个碱)下降10倍，同时核酸测序的成本(每个碱)下降10,000,000倍以上。DNA合成缺乏进展目前限制了转译基因组学的步伐，即，由此确定个别序列变异的作用并且用以改进治疗性治疗。目前，大多数新生核酸序列使用30多年前研发的固相亚磷酰胺技术合成。所述技术涉及由与天然(或非天然)核酸碱基对应的亚磷酰胺试剂构建的序列的依序去保护和合成。亚磷酰胺核酸合成长度受限，然而，这是因为长度大于200个碱基对(bp)的核酸会历经高断裂率和副反应。另外，亚磷酰胺合成会产生有毒副产物，并且这一废弃物的处置限制核酸合成器的可用性，并且增加合同寡核苷酸制造成本。(估计每年对寡核苷酸合成的需要会造成大于300,000加仑的有害化学废弃物，包括乙腈、三氯乙酸、甲苯、四氢呋喃以及吡啶。参见勒普罗斯特(LeProust)等人，核酸研究，第38(8)卷，第2522-2540页，(2010)(NucleicAcidsRes.,vol.38(8),p.2522-2540,(2010))，其以全文引用的方式并入本文中)。因此，需要更有效并且更具成本效益的寡核苷酸合成方法。
技术实现思路
本专利技术提供改进的核酸合成方法。本专利技术方法提供更快并且更长的聚核苷酸从头合成。由此，本专利技术大大降低合成常规核酸的总成本。本专利技术方法是针对使用核苷酸基转移酶来并入未经修饰的3'羟基通过可裂解连接子与抑制因子偶联的核苷酸类似物而不依赖模板地合成聚核苷酸。由于存在抑制因子，合成因添加每一新的碱基而停顿，因此连接子发生裂解，从而分离抑制因子并且离开聚核苷酸，这与天然产生的核苷酸本质上相同(即，通过酶识别为进一步核苷酸并入的底物)。本专利技术另外包括利用本专利技术方法产生定制聚核苷酸的设备。本专利技术的设备包括提供水性条件的一个或多个生物反应器和多个核苷酸类似物来源。生物反应器可以是例如储槽、流槽或多孔板。以固体支撑物起始，通过经由核苷酸基转移酶(例如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或无模板指向使DNA或RNA链伸长的任何其它酶)的天然活性添加连续核苷酸使聚核苷酸生长于反应器中。在连接子裂解时，天然聚核苷酸暴露于固体支撑物上。一旦序列完整，支撑物就会裂解掉，留下聚核苷酸，其实质上相当于自然界中所见的聚核苷酸。在一些实施例中，将设备设计为通过在核苷酸添加之后回收溶液并且将溶液再用于子序列核苷酸添加来回收核苷酸类似物溶液。因此，产生较少废弃物，并且，与目前先进技术方法相比每个碱基的总成本降低。在某些实施例中，生物反应器可以包括微流体装置和/或使用喷墨印刷技术。封端基团可以包括(例如)带电部分或空间抑制因子。一般来说，防止核苷酸基转移酶达成功能构形的大分子可以用以抑制寡核苷酸合成。此类大分子可以包括聚合物、多肽、类多肽以及纳米粒子。大分子应该足够大以从物理上阻止接近核苷酸基转移酶的活性位点，但又不会大到对反应动力产生不利改变。大分子可以使用多个连接分子连接到核苷酸类似物，如下所述。在一些实施例中，寡核苷酸合成可以包括在每一核苷酸类似物添加之后，但在封端基团裂解之前将3'核酸外切酶引入到一个或多个合成的寡核苷酸中。封端基团可以阻止3'核酸外切酶作用于已成功添加未裂解核苷酸类似物的寡核苷酸，但通过3'核酸外切酶将去除尚未成功添加抑制因子的寡核苷酸。以这种方式，本专利技术使得能够进行制程质量控制并且可以消除对合成后纯化的需要。本专利技术的其它方面将在考虑以下图式和具体实施方式后而为所属领域的技术人员所显而易知。附图说明图1A展示在N-4位连接有可裂解终止子的一种脱氧胞苷三磷酸(dCTP)类似物；图1B展示来自图1A的dCTP类似物的可裂解终止子的裂解，以获得“天然”dCTP和环状离去分子；图2A展示在N-6位连接有可裂解终止子的一种脱氧腺苷三磷酸(dATP)类似物；图2B展示来自图2A的dATP类似物的可裂解终止子的裂解，以获得“天然”dATP和环状离去分子；图3A展示在N-2位连接有可裂解终止子的一种脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)类似物；图3B展示来自图3A的dGTP类似物的可裂解终止子的裂解，以获得“天然”dGTP和环状离去分子；图4A展示在N-3位连接有可裂解终止子的一种脱氧胸苷三磷酸(dTTP)类似物；图4B展示来自图4A的dTTP类似物的可裂解终止子的裂解，以获得“天然”dTTP和环状离去分子；图5A展示在N-3位连接有可裂解终止子的一种脱氧尿苷三磷酸(dUTP)类似物；图5B展示来自图5A的dUTP类似物的可裂解终止子的裂解，以获得“天然”dUTP和环状离去分子；图6展示例示性脱氧胞苷三磷酸(dCTP)类似物，其具有使封阻Asp-Asp分子连接到脱氧胞苷的N-4位的施陶丁格(Staudinger)连接子并且随后在水性条件下使施陶丁格连接子裂解以获得dCTP和离去基；图7A展示在N-4位连接有可裂解终止子的一种胞嘧啶核苷三磷酸(rCTP)类似物；图7B展示来自图7A的rCTP类似物的可裂解终止子裂解以获得“天然”rCTP和环状离去分子；图8A展示在N-6位连接有可裂解终止子的一种腺苷三磷酸(rATP)类似物；图8B展示来自图8A的rATP类似物的可裂解终止子裂解以获得“天然”rATP和环状离去分子；图9A展示在N-2位连接有可裂解终止子的一种鸟苷三磷酸(rGTP)类似物；图9B展示来自图9A的rGTP类似物的可裂解终止子裂解以获得“天然”rGTP和环状离去分子；图10A展示在N-3位连接有可裂解终止子的一种胸苷三磷酸(rTTP)类似物；图10B展示来自图10A的rTTP类似物的可裂解终止子裂解以获得“天然”rTTP和环状离去分子；图11A展示在N-3位连接有可裂解终止子的一种尿苷三磷酸(rUTP)类似物；图11B展示来自图11A的rUTP类似物的可裂解终止子裂解以获得rUTP和环状离去分子；图12展示例示性胞嘧啶核苷三磷酸(rCTP)类似物，其具有使封阻Asp-Asp分子连接到胞嘧啶核苷的N-4位的施陶丁格连接子并且随后在水性条件下使施陶丁格连接子裂解以获得rCTP和离去基；图13展示例示性末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的聚核苷酸合成循环，其包括：(a)并入包含可裂解终止子的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种合成寡核苷酸的方法，其包含：在存在核苷酸转移酶和不存在核酸模板下使连接到固体支撑物的寡核苷酸暴露于核苷酸类似物，以使得所述核苷酸类似物并入所述寡核苷酸中，其中所述核苷酸类似物包含通过可裂解连接子与抑制因子偶联的核苷酸，所述抑制剂在空间上防止所述核苷酸基转移酶催化核苷酸或其它核苷酸类似物向所述寡核苷酸中并入直到通过裂解该等可裂解连接子而将所述抑制剂去除。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.18 US 62/038,604;2014.10.27 US 62/069,0671.一种合成寡核苷酸的方法，其包含：在存在核苷酸转移酶和不存在核酸模板下使连接到固体支撑物的寡核苷酸暴露于核苷酸类似物，以使得所述核苷酸类似物并入所述寡核苷酸中，其中所述核苷酸类似物包含通过可裂解连接子与抑制因子偶联的核苷酸，所述抑制剂在空间上防止所述核苷酸基转移酶催化核苷酸或其它核苷酸类似物向所述寡核苷酸中并入直到通过裂解该等可裂解连接子而将所述抑制剂去除。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸类似物包含以下结构：3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸类似物包含以下结构：4.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制因子包含以下结构：其中n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制因子包含类多肽。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制因子包含聚合物。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述聚合物包含聚乙二醇。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制因子是蛋白。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制因子是纳米粒子。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制因子是直径大于的大分子。11.根据权利要求1所述的方法，其中连接到所述固体支撑物的所述核酸在存在水溶液下暴露于pH值在约6.5与8.5之间的所述核苷酸类似物。12.根据权利要求1所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·W·爱夫卡维茨，
申请(专利权)人：分子组装公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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