用于治疗癌症的辐射菌的生产方法技术

本发明专利技术提供一种生产辐射菌的方法，尤其是辐射李斯特菌‑

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗癌症的辐射菌的生产方法相关申请的交叉引用本申请要求于2014年11月4日提交的申请号为62/074,702的美国临时申请的优先权，其内容通过引用并入本文。
技术介绍
在本申请中，各种出版物以括号中的数字表示。这些参考文献的完整引用可在说明书的末尾处找到。这些出版物和本文引用的所有书籍、专利和专利申请出版物的公开内容通过引用整体并入本申请中，以便更全面地描述本专利技术适用的主题中的现有技术。胰腺导管腺癌，即胰腺癌的是癌症死亡的第四大原因。“无症状杀伤者”的特征是在检测到原发肿瘤被之前的转移行为(3)，导致5年存活率仅为4％。目前的癌症治疗手段，即伴随放疗和/或化疗的手术，对转移灶是无效的。经FDA批准的胰腺癌治疗药物：吉西他滨和厄洛替尼，可在晚期患者中提高中位生存期约6个月(1-3)，急切需要新的胰腺癌替代疗法。这种新方法可是基于单核细胞增生李斯特菌的癌症治疗方法。该实验室发现，高度减毒的李斯特菌(李斯特菌at)提供了对转移性癌症特别有用的治疗方法。骨源性抑制细胞(MDSC)通常是癌症疫苗接种中的主要问题，因为它们强烈地抑制T细胞和自然杀伤(NK)细胞反应并促进血管生成(4-10)，导致癌细胞转移的发生。然而，当感染李斯特菌at时，MDSC通过其免疫抑制特征(Chandra等人未发表的结果)保护李斯特菌at不被免疫清除，并且将李斯特菌at安全地传送到肿瘤微环境中，其中李斯特菌at通过高水平的活性氧物质(ROS)感染和杀死肿瘤细胞(11)。同时，李斯特菌at—特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀死肿瘤细胞，因为被感染的肿瘤细胞存在李斯特菌at抗原(11)。重要的是，在缺乏免疫抑制的正常组织中，李斯特菌at被巨噬细胞、NK细胞和CTL(11,12)快速清除，使得这种治疗对于人类来说是安全的。靶向放射性核素治疗在治疗多种癌症已被证明是成功的，并且其使用放射性标记的小分子、单克隆抗体、肽和其他肿瘤靶向载体(13)。由放射性核素放射的放射性粒子物理破坏癌细胞，而这种疗法不受多重耐药机制的影响。已经有人尝试将以放射性标记的肿瘤特异性抗体(Ab)(放射免疫疗法)的形式的靶向放射性核素疗法用于治疗胰腺癌。然而，胰腺癌的放射免疫治疗在临床(14-16)和不可手术切除的肝转移癌的癌症患者中均显示出差强人意的结果(17)。需要重新选择靶向载体以使靶向放射性核素治疗方法成功治疗胰腺癌。用包含放射性同位素标记抗体的细菌疗法已经被提出(例如，参见编号为2014-0417379-A1的美国专利申请，其通过引用并入本文)，但是需要更简单、更有效和更经济的制造辐射菌的方法。本专利技术通过提供一种更简单且更有效和经济的生产辐射菌的方法来满足对新靶向癌症疗法的需求。
技术实现思路
提供一种生产辐射菌的方法。在一个实施例中，该方法包括获得细菌培养物，使所述细菌在盐水溶液中饥饿5至60分钟，随后将细菌在含放射性核素的培养基中培养5至240分钟，以产生辐射菌。同时提供了治疗受试者肿瘤、或者减少或预防受试者肿瘤转移灶的方法，包括向受试者施用一定量的通过本文公开的任何方法生产的辐射菌，其能有效治疗受试者中的肿瘤、或者减少或预防受试者肿瘤的转移。附图说明图1：将32P掺入李斯特菌：李斯特菌在盐水中饥饿30分钟，然后在无磷酸盐培养基(爱丁堡无磷酸盐基本培养基)中培养1小时，然后洗涤并重新悬浮于注射用盐水中(107/200μl)。以用于重现性，如x轴所示，重复实验。图2：李斯特菌-32P的存活率：将32P掺入李斯特菌后，将李斯特菌的存活率与未经处理的李斯特菌进行比较(存活的李斯特菌32P/存活的未处理李斯特菌×100％)。如x轴所示，该实验重复数次。误差线表示平均值(SEM)的标准误差。图3A-3B：肿瘤细胞感染率：将具有李斯特菌-32P(LM-P32)的4T1肿瘤细胞的感染率与未处理的李斯特菌(LM)(A)进行比较。感染1小时后每株的CFU数。如x轴所示，该实验重复数次。误差线表示平均值(SEM)的标准误差。同时用Panc-02细胞(B)测验感染率。图4：将放射性计数结合到正常组织中：在使用李斯特菌-32P处理结束后，将小鼠安乐死，并使用闪烁计数器分析组织的放射性计数，并使用以32P的已知量(μCi)为标准曲线对μCi进行归一化。P32单独强烈结合到骨髓(BM)细胞中，但没有32P结合到李斯特菌中。图5：李斯特菌-32P在Panc-02模型中的功效研究：将2×106个Panc-02肿瘤细胞接种到C57B16小鼠的乳腺脂肪垫中。三天后，每三天(ip)将小鼠用李斯特菌-32P(107CFU)处理直到第20天。所有小鼠在第21天被安乐死，并分析癌细胞转移数量和肿瘤重量。所有未经治疗的小鼠在21天内在乳腺脂肪发现了小型原发性肿瘤，在肝脏和其他器官中发现转移灶，以及在腹腔中发现腹水。N＝5只小鼠/组。在2组实验中的对照组中，5只小鼠中有4只没有癌症。曼-惠特尼检验*p<0.05，**p<0.01。发现转移灶显著出现在肝脏中。图6：李斯特菌-32P几乎完全消除了Pane-2模型中的肝脏转移灶。图7：李斯特菌渗入胰腺肿瘤，转移瘤和正常组织。6个月和4个月大的具有胰腺肿瘤(其中一只小鼠有转移瘤)的KPC小鼠注射107CFU的李斯特菌，第二天分析李斯特菌的CFU数。将小鼠组织在磨砂载玻片之间浸渍，使细胞在水中溶解，并在琼脂上铺板。李斯特菌主要在肿瘤、转移灶、胰腺(胰腺组织不能从胰腺肿瘤中宏观分离)中被发现。请注意，在骨髓中发现的细菌数为零。图8：患有Panc-02肿瘤和转移灶的P-小鼠的生物分布，用107李斯特菌-32P注射一次，并以不同的时间间隔(1，2，4，24，48，和96小时)分析原发肿瘤、转移灶和各种正常组织中的辐射菌数量。如图所示，32P在转移灶和肿瘤中数量最高，特别是在注射1和4小时后，而在注射24，48和96小时后，32P水平降低，但与正常组织相比数量仍然很高。在肝脏处发现异常，因为转移灶已经蔓延到这个器官。图9：剂量限制性毒性(DLT)研究——将不同剂量的李斯特菌-32P注射到没患癌症的C57B16小鼠中，并在接下来的5天内测定存活时间。如图所示，107CFU是最佳剂量，而108CFU小鼠在第1天及之后就死亡，这与单独注射李斯特菌的结果LD50＝108一致。这些结果表明，每次注射107CFU剂量的李斯特菌-32P，其发出的1μCi射线是无毒的。即使在接受12剂量的107CFU李斯特菌-32P的小鼠中，没有副作用的结论也得到了病理报告的支持。图10：李斯特菌-32P对已确诊的肿瘤和转移灶的影响——利用李斯特菌-32P和盐水对已确诊的肿瘤(0.5-1cm)和转移灶进行研究。简言之，连续四天注射107CFU李斯特菌-32P三个循环，然后在每个周期之间休息三天(总共12次)。与以前的实验相反，第一次治疗是在第10天而不是在第3天开始。如图所示，李斯特菌-32P治疗有效地根除了肿瘤和转移灶。方差分析*p<0.05，**p<0.005是显著的。图11：血清中李斯特菌-32P的解离度——通过在37℃下将李斯特菌-32P与血清一起培养来分析李斯特菌-32P在血清中的稳定性。在0，1，2和3小时后，将RL细菌离心，分析上清液的放射性计数。通过将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产辐射菌的方法，其特征在于，包括获得细菌培养物，在盐水溶液中饥饿所述细菌5至60分钟，随后将细菌放置在含放射性核素的培养基中培养5至240分钟，以产生辐射菌。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.04 US 62/074,7021.一种生产辐射菌的方法，其特征在于，包括获得细菌培养物，在盐水溶液中饥饿所述细菌5至60分钟，随后将细菌放置在含放射性核素的培养基中培养5至240分钟，以产生辐射菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含放射性核素的培养基补充有32P，并且培养基中不含磷酸盐，所述细菌在该培养基中生长。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细菌是减毒的。4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述细菌是单核细胞增生李斯特菌。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述放射性核素为32P。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述细菌在含放射性核素的培养基中生长50-70分钟。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细菌在含放射性核素的培养基中培养60分钟。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，还包括随后洗涤辐射菌并回收它们。9.一种用于治疗受试者的肿瘤，或用于减少或预防受试者的肿瘤转移灶的方法，其特征在于，包括向所述受试者施用一定量的根据权利要求1-8中任一项所述的方法生产的辐射菌，其有效治疗所述受试者的肿瘤，或减少或预防受试者中肿瘤的转移灶。10.根据权利要求9所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：克劳迪娅·格雷夫坎普，叶卡捷琳娜·达达乔瓦，迪内希·钱德拉，
申请(专利权)人：阿尔伯特爱因斯坦医学院股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US