使用胶凝剂跟踪单细胞的新型生物活性测试结构制造技术

本发明专利技术涉及一种用于使用胶凝剂的单细胞跟踪的新型生物活性测试结构和包括测试结构的生物活性测试系统。本发明专利技术还涉及使用测试结构的生物活性测试、药物敏感性测试、抗生素筛选和诊断方法。本发明专利技术的生物活性测试结构实现了非常快速且简单的细菌，特别是结核分枝杆菌的药物敏感性测试、药物筛选和细菌诊断。特别地，使用测试结构可以仅通过预处理进行DST和细菌的诊断，而不需要浓缩人类痰样品，不考虑接种效应，确保与常规结核病诊断或DST系统相比，更快速、准确且简单的测试。此外，本发明专利技术的测试结构同时能够进行结核病的诊断和药物敏感性测试。因此，本发明专利技术提供了现有技术的有效替代方案。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用胶凝剂跟踪单细胞的新型生物活性测试结构
本专利技术涉及一种用于使用胶凝剂跟踪单细胞的新型生物活性测试结构和包括测试结构的生物活性测试系统。另外，本专利技术还涉及使用上述测试结构的生物活性测试、药物敏感性测试、抗生素筛选和诊断方法。
技术介绍
威胁全世界三分之一人口健康的传染病是结核病(TB)。尽管存在抗结核药物，但全世界每年约1％的人口感染结核病且130万人死于结核病。由于对TB患者或TB疑似群体管控不善，多重耐药性结核病(MDR-TB)和广泛耐药性结核病(XDR-TB)正逐渐增加。近年来，首例完全耐药性结核病(TDR-TB)已被报道出现在印度。为了减少结核病的传播并改善结核病患者的疗效，在药物敏感性测试(DST)之后需要进行快速且准确的药物治疗。TB对标准一线抗TB药剂中的某些药物的耐药性的诊断在确定MDR-TB、XDR-TB和XDR-TB以及避免药物治疗无效方面是非常重要的。常用DST方法是基于在固体和液体培养基上培养细胞。根据固体培养基培养方法，结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)(MTB)接种于包含抗生素的固体培养基中，并用肉眼测试观察是否形成菌落。由于MTB缓慢生长(细胞分化约24小时)，因而常规的DST方法耗费至少4-6周。对于液体培养基，MTB生长被加速，并可以减少DST所需的时间。可以利用使用了被称为MGIT960系统的液体培养基的商用DST平台。MGIT系统测试随着MTB生长并消耗氧产生的荧光信号。该MGIT系统的DST时间短至约为1周，然而，这种方法导致错误率的增加，原因是MTB细胞的生长不是被直接观察到，而是间接确定的。为了缩短DST时间，开发了直接观察的显微镜观察药物敏感性(MODS)方法。根据该方法，将痰样品与药物一起接种在24孔板中，且每天监测菌落形成，这在确定MTB是否生长中起重要作用。该方法可以在一周内产生DST结果。然而，由于MTB的单细胞不能固定在液体培养基中，使得不可能跟踪单细胞。该方法可以在一周内产生DST结果。然而，由于MTB的单细胞不能固定在液体培养基中，使得不可能跟踪单细胞。为了获得DST结果，在整个孔区域的显微镜观察对于测试菌落形成是必不可少的，并且长期观察是不可避免的。已经开发了许多实验室芯片技术用于单细胞跟踪：使用微尺度孔的阵列、被动微流体捕获、主动阀微流体系统和液滴微流体。在使用微尺度孔和被动微流体捕获的阵列方法中，细胞通过重力沉降并通过流体流动被捕获在堰板中。然而，与控制流体环境相关的困难阻碍了药物测试的多重测定。为了更好地控制细胞和药物负载，主动阀微流体方法采用计算机控制的气动致动捕获方法，通过多个控制元件准确控制少量液体。然而，这种方法依赖于复杂的控制，这带来高成本和过多的运营努力。因此，该方法不适用于常规临床药物测试。液滴微流体采用少量腔室用于复用药物测试。然而，这些方法不能保证细菌细胞在液滴内的固定，这对于单细胞跟踪是必需的。接种效应(IE)在实验室中是不希望的现象，并可能导致在体外耐药性的过高估计，导致最小抑菌浓度(MIC)的增加。因此，接种效应恶化了实验再现性。此外，由于MIC是确定抗生素在药效学中的微生物功效的参数，通过细胞密度不同的MIC值可以限制抗生素的临床评价。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题本专利技术人认真深入研究开发有效和快速诊断细菌，特别是结核分枝杆菌、DST和筛选的方法，结果专利技术了一种新的腔室(简称“DAC系统”)，以制成薄层的琼脂糖混合物，并在薄层之上具有畅通表面用于供给液体培养基和药物。此外，本专利技术人已经发现，DAC系统对于快速和简单的药物DST、药物筛选和结核病诊断是有效的。基于这些发现实现了本专利技术。因此，本专利技术的一个目的是提供一种新的生物活性测试结构和包括其的生物活性测试系统。另外，本专利技术的另一个目的是提供一种用于使用生物活性测试结构进行的生物活性测试、细菌的抗生素敏感性测试、抗生素筛选和细菌诊断的方法。解决问题的手段本专利技术的一个方面提供一种生物活性测试结构，其包括板体，布置在板体上的一个或多个培养单元100和底板110，在底板110下面，在每个培养单元的底面上将形成固体薄膜。生物活性测试可能是药物敏感性、药物筛选或细菌培养诊断测试。每个培养单元还可以具有形成在底板之上的容纳凹陷部120。每个培养单元可以具有形成在底板中的入口111，并且含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液将通过该入口111引入。每个培养单元100可以具有一个或多个连接构件113，基板110通过该连接构件113连接到板体的阻挡部(分隔壁)和形成在连接构件之间的切割凹槽114。每个培养单元可以具有形成在基板110中的一个或多个贯通孔112。优选地，每个培养单元100具有1-50mm×1-50mm的尺寸和1-50mm的高度。优选地，容纳凹陷部120具有1-5mm的宽度和1-3mm的高度。混合溶液在底板下被固化，形成生物剂被固定的固体薄膜。薄膜可以具有1μm至10mm的厚度，并且混合溶液中的生物剂的密度可以为101至1080cfu/ml。胶凝剂不限于特定种类，其可以是琼脂，琼脂糖，明胶，藻酸盐，胶原蛋白或纤维蛋白。可以将生物活性剂进一步引入培养单元中，且更优选地，将生物活性剂以冷冻干燥的形式引入到容纳凹陷部中。板体、培养单元和底板可以由透明或半透明的材料制成。本专利技术的另一方面提供了一种生物活性测试方法，其包括：将含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液提供到生物活性测试结构的底面；固化混合溶液以形成固体薄膜，其中生物剂被固定在固体薄膜中；向固体薄膜供应生物活性剂并允许生物活性剂扩散到固体薄膜中；以及观察生物剂的单细胞对生物活性剂的个体应答或观察生物剂是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。该方法可以进一步包括将生物剂的单细胞对生物活性剂的个体应答、生物剂的菌落或菌落形成单位(CFU)进行成像，并分析图像。更优选地，该方法还包括基于图像的分析确定生物活性剂的最小抑菌浓度(MIC)。本专利技术还提供了一种用于细菌的抗生素敏感性测试方法，其包括：向生物活性测试结构的底面提供含有胶凝剂和细菌菌株的液体培养基的混合溶液；固化混合溶液以形成固体薄膜，其中细菌菌株被固定在固体薄膜中；向固体薄膜提供抗生素并使抗生素扩散到固体薄膜中；以及观察细菌菌株的单细胞对抗生素的个体应答或观察细菌菌株是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。优选地，该方法还包括对单细胞的个体应答、菌落或菌落形成单位(CFU)进行成像，分析图像以及基于图像分析确定抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。细菌菌株可以是结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌(NTM)。结核分枝杆菌可能是多重耐药性(MDR)结核病、广泛耐药性(XDR)结核病或完全耐药性(TDR)结核病。该方法显示无接种效应。本专利技术的另一方面提供了一种抗生素筛选方法，其包括：向生物活性测试结构的底面提供含有胶凝剂和细菌菌株的液体培养基的混合溶液；固化混合溶液以形成固体薄膜，其中细菌菌株被固定在固体薄膜中；向固体薄膜提供抗生素并允许抗生素扩散到固体薄膜中；以及观察细菌菌株的单细胞对抗生素的个体应答或观察细菌菌株是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。该方法还可以包括对单细胞的个体应答、菌落或菌落形成单位(CFU)进行成像，分析图像本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物活性测试结构，包括板体、布置在所述板体上的一个或多个培养单元以及底板，在所述底板下面，每个培养单元的底面上形成有固体薄膜。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生物活性测试结构，包括板体、布置在所述板体上的一个或多个培养单元以及底板，在所述底板下面，每个培养单元的底面上形成有固体薄膜。2.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，所述生物活性测试是药物敏感性、药物筛选或细菌培养诊断测试。3.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，每个所述培养单元还具有形成在所述底板之上的容纳凹陷部。4.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，每个所述培养单元具有形成在所述底板中的入口，并且通过所述入口引入含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液。5.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，每个所述培养单元具有一个或多个连接构件，所述底板通过所述连接构件与所述板体的阻挡部和形成在所述连接构件之间的切割凹槽连接。6.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，每个所述培养单元具有在所述底板中形成的一个或多个贯通孔。7.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，每个所述培养单元的尺寸为1-50mm×1-50mm且高度为1-50mm。8.如权利要求3所述的生物活性测试结构，其特征在于，所述容纳凹陷部的宽度为1-5mm且高度为1-3mm。9.如权利要求4所述的生物活性测试结构，其特征在于，将含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液在所述底板下固化以形成生物剂被固定的固体薄膜。10.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，薄膜的厚度为1μm至10mm。11.如权利要求4所述的生物活性测试结构，其特征在于，所述混合溶液中的所述生物剂的密度为101cfu/ml至1080cfu/ml。12.如权利要求4所述的生物活性测试结构，其特征在于，所述胶凝剂选自由琼脂、琼脂糖、明胶、藻酸盐、胶原蛋白、纤维蛋白及其混合物组成的组。13.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，将生物活性剂进一步引入所述培养单元中。14.如权利要求13所述的生物活性测试结构，其特征在于，所述生物活性剂以冷冻干燥的形式引入所述容纳凹陷部中。15.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，所述板体、所述培养单元和所述底板由透明或半透明材料制成。16.一种生物活性测试方法，包括：将含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液提供到如权利要求1至15中任一项所述的生物活性测试结构的底面；固化所述混合溶液以形成固体薄膜，所述生物剂被固定在所述固体薄膜中；向所述固体薄膜提供生物活性剂并允许所述生物活性剂扩散到所述固体薄膜中；以及观察所述生物剂的单细胞对所述生物活性剂的个体应答或观察所述生物剂是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。17.如权利要求16所述的生物活性测试方法，还包括将所述生物剂的所述单细胞对所述生物活性剂的个体应答、所述生物剂的所述菌落或所述菌落形成单位(CFU)进行成像，并分析所述图像。18.如权利要求17所述的生物活性测试方法，还包括基于所述图像的分析来确定所述生物活性剂的最小抑菌浓度(MIC)。19.一种用于细菌的抗生素敏感性测试的方法，包括：将含...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑勇均，金殷勤，刘正宪，朴京玉，权圣勋，崔祯日，金喜镇，柳诚源，金贺恩，郑呟周，李恩姬，金惠珍，
申请(专利权)人：昆塔麦特利斯株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR