肽组合物及其用途制造技术

本发明专利技术主题是含肽ESAT‑6的至少一个片段和肽CFP‑10的至少一个片段的组合物。优选地，片段包含至少两组肽，第一组包含长度为约7至14个氨基酸残基的至少一个肽，第二组包含16个或更多氨基酸残基的至少一个肽。本发明专利技术还涉及用所述组合物的诊断方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肽组合物及其用途相关申请的交叉参考本申请要求2014年10月23提交的欧洲专利申请EP14190111.6的权益，其通过引用将该申请全文纳入本文。
技术介绍
本专利技术一般涉及基于免疫学的诊断试验领域，所述基于免疫学的诊断试验包括检测细胞介导的免疫应答力试验。基于免疫学的诊断试验是检测各种病症的重要手段。这些试验类型的效果部分在于免疫系统内成分的特异性。尽管有这样的特异性，但对于在具有活性或潜伏感染疾病状态的对象中检测低级感染或持续低水平感染而言，基于免疫学的诊断不一定总是足够灵敏。需要开发在细胞介导的免疫应答力方面灵敏度提高的诊断试验。基于免疫学的一种诊断方法形式涉及在分离细胞培养或全血液培养中用抗原或有丝分裂原激活T细胞，然后是检测效应分子，例如刺激T细胞(也称为效应T细胞)生成的细胞因子。效应分子一般用诸如酶免疫分析、多元珠分析、酶联免疫斑点法(ELISpot)和流式细胞仪等技术检测。然而，对于常规诊断应用而言，此类试验的灵敏度和选择性通常不足。快速评估细胞介导免疫性的能力和具有高度的灵敏度是具有临床重要性的。尤其是在免疫系统受损的患者中。临床医师需要了解疾病状态发展及其对宿主免疫系统的影响。WO2013/000021A1公开了灵敏度增加的改善的细胞介导的免疫响应试验。测定对象中细胞介导的免疫应答活性的方法包括将来自对象的淋巴细胞与至少两组肽接触，第一组包括约7-14个氨基酸残基长度的至少一种肽，第二组包括16个或更多氨基酸残基的至少一种肽，所述肽包括全部或部分的蛋白质抗原。诱导细胞免疫反应的各种蛋白质抗原已在本领域公开。例如WO95/01441A1公开了从分枝杆菌分离的肽抗原ESAT-6。WO97/09429A2公开了从分枝杆菌分离的肽抗原CFP-10。Laurens等(Clin.andDiagn.Lab.Imm.,2000年3月，第7期第2版,155-160页)公开了基于ESAT-6和CFP-10诊断结核病的方法。他们发现，相比使用分开的抗原，两种抗原的组合增加了体内和体外诊断试验的灵敏度和特异度。WO2008/141226公开了各种抗原(例如ESAT-6和CFP-10)的细菌表达系统。该文件未涉及抗原的片段。WO2009/024822公开了用于疫苗的抗原列表，但其未公开或教导特异组合CFP-10和ESAT-10或其片段。WO2014/085713A1涉及基于标志物蛋白检测结核病的方法和组合物。公开了诊断试验，其中通过胰蛋白酶消化在探针中获得ESAT-6和CFP-10的大片段。该文未公开肽的限定组或该肽与淋巴细胞相互作用的方法。然而，当前需要新的灵敏且选择性的抗原组合物以及相应的免疫基诊断试验。本专利技术背后的问题本专利技术背后的问题是提供新的灵敏且选择性的抗原组合物以及相应的免疫基诊断试验。此外，问题是提供改善的组合物和诊断结核病的试验。
技术实现思路
令人惊奇的发现本专利技术背后的问题被权利要求所述的组合物和方法所克服。本专利技术进一步实施方式如本文所示。本专利技术主题是含ESAT-6的至少一个片段和CFP-10的至少一个片段的组合物。如上所用，“片段”是具有比全长ESAT-6或CFP-10更少的氨基酸的肽。本专利技术组合物包含ESAT-6和CFP-10的片段。然而，并不排除存在的其他片段或抗原。在本专利技术一个实施方式中，不存在其他片段和/或抗原。该实施方式中，组合物中的免疫原性肽全部是ESAT-6和CFP-10的片段。在优选实施方式中，片段包含至少两组肽，第一组包含长度为约7至14个氨基酸残基的至少一个肽，第二组包含16个或更多氨基酸残基的至少一个肽。该实施方式中，长度为约7至14个氨基酸残基的第一组肽可称为“短肽”，包含16个氨基酸残基或更多的至少一个肽的第二组可称为“长肽”。在优选实施方式中，肽涵盖蛋白抗原ESAT-6和CFP-10的部分。在一个实施方式中，第一和第二组肽各包含ESAT-6和CFP-10的片段。根据本专利技术，不排除ESAT-6和CFP-10的其他片段为组合物的一部分。因此，还可存在长度高至6个氨基酸或15个氨基酸的ESAT-6和CFP-10的片段。在优选实施方式中，全长ESAT-6和/或CFP-10不是组合物的一部分。在其他实施方式中，不包含长度大于75、50或25个氨基酸的ESAT-6和/或CFP-10的片段。ESAT-6(UniProt登录号:P0A564；Entrez登录号:886209)是6kDa的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)早期分泌抗原性靶标。WO95/01441A1公开了蛋白质序列和从分歧杆菌中分离的方法。CFP10(UniProt登录号:P0A566；Entrez登录号:886194)也称作ESAT-6样蛋白eesxB和分泌的抗原性蛋白MTSA-10。WO97/09429A2公开了序列和从分歧杆菌中分离CFP-10的方法。Laurens等(Clin.andDiagn.Lab.Imm.,2000年3月，第7期第2版,155-160页)公开了基于ESAT-6和CFP-10诊断结核病的方法。他们发现，相比使用分开的抗原，两种抗原的组合增加了体内和体外诊断试验的灵敏度和特异度。然而，现有技术未公开本专利技术组合物，其合并了ESAT-6和CFP-10的片段用于诱导细胞免疫应答。“约7-14个氨基酸”表示7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸。这在本文中考虑第一组肽。“大于15个氨基酸”表示16个至全长蛋白质抗原，包括16-50个氨基酸。本文中其涉及第二组肽。本专利技术不限于何组肽被称为第一或第二。各组包含至少一种肽至一系列重叠的肽。具有16个或更多氨基酸内的“长肽”的长度受ESAT-6(95个氨基酸)和CFP-10(100个氨基酸)的长度所限。在具体实施方式中，长肽的最大长度小于90、小于75、小于50或小于30个氨基酸。可通过已知方法获得肽，例如体外或体内的重组肽生产方法，或通过消化ESAT-6、CFP-10或其衍生物。衍生自蛋白抗原的7-14个氨基酸的肽和大于15个氨基酸的肽与淋巴细胞的共孵育产生更灵敏的试验，能够比其它可能的情况更早地检测淋巴细胞刺激。增加的灵敏度包括：相较于源自抗原的7-14个氨基酸范围或>15个氨基酸范围或完整抗原本身的单个肽的共孵育，对效应器分子的检测增加至少10％。增加细胞介导的免疫应答试验灵敏度的能力还允许检测效应分子的灵敏度较低的方法。此外，在本文公开的试验中的细胞介导的免疫应答的检测的量级可能与疾病阶段、发展和/或严重性相关。因此，本公开内容指导对象内细胞介导的免疫应答力的试验。不受理论或作用模式的限制，两组肽(7-14聚体肽和>15聚体的肽)允许通过CD4+和CD8+T细胞的检测VCD4+T细胞识别>15聚体的肽且CD8+T细胞识别7-14聚体的肽。这些肽在本文中称为“CD4+肽”(>15聚体的肽)或“CD8+肽”(7-14聚体的肽)。优选组合物包含约7-14个氨基酸残基的多种肽和16个或更多氨基酸残基的多种不同的肽。在这一方面，“多种肽”指可包含例如2-2000、优选10-1000或20-500个不同肽的池。当包含多种肽时，免疫应答通常得到改善。在优选实施方式中，组合物还包含至少一种糖。优选所述糖是非还原糖，本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含ESAT‑6的至少一个片段和CFP‑10的至少一个片段的组合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.23 EP 14190111.61.包含ESAT-6的至少一个片段和CFP-10的至少一个片段的组合物。2.如权利要求1所述的组合物，其中所述片段包含至少两组肽，第一组包含长度为约7至14个氨基酸残基的至少一种肽，第二组包含16个或更多氨基酸残基的至少一种肽。3.如前述权利要求中至少一项所述的组合物，其中所述7至14个氨基酸的肽由CD8+淋巴细胞识别，并且所述16个或更多氨基酸的肽由CD4+淋巴细胞识别。4.如前述权利要求中至少一项所述的组合物，其还包含至少一种糖。5.如权利要求4所述的组合物，其中所述糖是非还原糖，优选海藻糖。6.一种检测对象中细胞介导的免疫应答活性的方法，所述对象优选人，所述方法包括使来自对象的淋巴细胞接触权利要求1-5中至少一项所述的组合物，和检测来自免疫细胞的免疫效应物分子的存在或升高，其中，免疫效应物分子的存在或水平指示该对象中细胞介导的应答力的水平。7.如权利要求6所述的方法，其中所述样品是未稀释的全血，其中优选所述全血收集在含肝素的管中。8.如权利要求6-7中至少一项所述的方法，其中所述免疫效应物分子是细胞因子，优选IFN-γ。9.如权利要求6-8中至少一项所述的方法，其中所述免疫效应物用对其具有特异性的抗体来检测，优选使用ELISA。10.权利要求6-9中至少一项所述的方法，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·博伊尔，
申请(专利权)人：凯杰科技有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US