用于体外和体内检测革兰氏阴性细菌的分子探针制造技术

提供了包含标签和结合部分的探针，其中结合部分适于结合革兰氏阴性细菌并且基本上不结合动物细胞或革兰氏阳性细菌。还提供了在靶区域中检测细菌的存在的方法，其通常允许检测细菌和确定该细菌是革兰氏阴性的还是革兰氏阳性的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于体外和体内检测革兰氏阴性细菌的分子探针专利
本专利技术涉及分子探针领域，更具体地涉及用于检测微生物诸如细菌和真菌的分子探针。专利技术背景在世界各地存在日益增加的感染负担，且准确诊断仍然是提供准确治疗的基础。医院内和保健所的患者通常有感染的危险。医院获得性感染(HAI)变得更加普遍，且迅速准确地应对此类感染的能力越来越重要。严重患病的患者的免疫系统往往至少部分受损，使患者特别容易受到HAI的伤害。重症监护的用呼吸机供氧的患者和所有免疫受损的患者特别容易受到HAI的伤害，最具破坏性的HAI之一仍然是呼吸机相关性肺炎(VAP)。众所周知地，VAP仍然难以准确诊断，并且已经显示不恰当的治疗对患者有害。因此，VAP具有高死亡率、高发病率并且仍然是医疗资源的负担。在诊断方面，发烧、增加的氧依赖性和心动过速的临床征象仍然是检测炎症或急性肺损伤的非特异性手段，而金标准仍然是肺活组织检查，其是侵入性的并且由于该测试的固有侵入性性质而是很少被使用的探查。其他方法诸如支气管肺泡灌洗(bronchoalveolarlavage)仍然存在争议，而非培养方法没有任何显著影响或稳健的验证。因此，需要允许准确且及时诊断VAP的可选择的方法，其将允许进行快速的医疗决定和以恰当的疗法改善患者结局。目前，关于何时和是否开始抗微生物治疗、选择使用的剂以及如果开始了治疗，何时逐步降级治疗，临床医师面对极大的不确定性。这些问题是有效的抗生素管理的障碍，因为延迟和不足的抗生素治疗与不良临床结果之间存在已被证明的关联。分子成像技术可以允许使用微生物特异性示踪剂，并且当与成像模态(modalities)诸如正电子发射断层扫描(PET)组合时，具有描绘无菌部位的感染性的能力。然而，此方法不适用于一些患者组，诸如需要现场护理诊断测试的重症监护组群体，并且施用放射性剂可能造成困难且是限制性的。这些还涉及辐射并且不容易适用于在医院环境以外成像。本领域中可选择的方法是应用光学探针，以允许通过使用内镜来使患者的靶区域直接可视化。属于VisenMedical,Inc.的WO2003/079015公开了用于鉴定和表征正常和关于改变的代谢活性的患病组织的光学成像探针。属于本申请人的WO2012/136958公开了当染料被特定细胞类型内化时，通过增加荧光来允许细胞在体内可视化的支化染料(brancheddye)。然而，仍存在对于确定炎症的起因的改善的方法的需求，该方法将允许在原位、现场护理确定患者的状况是否由感染引起，并且如果是，确定该感染是细菌感染或真菌感染。因此，本专利技术的目的是提供适于快速和准确的现场护理诊断的改进的成像/检测方法。专利技术描述根据本专利技术的第一方面，提供了在靶区域中检测细菌和/或真菌的方法，所述方法包括步骤：(1)提供适于标记细菌和/或真菌的第一探针；(2)将所述第一探针递送到所述靶区域；(3)用适当波长的光照射所述靶区域以激发所述第一探针；(4)确定所述靶区域中的细菌和/或真菌是否已被所述第一探针标记；如果确定所述靶区域中的细菌已经被所述第一探针标记，则所述方法还包括步骤：(5)提供适于仅标记革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌的第二探针；(6)将所述第二探针递送到所述靶区域；(7)用适当波长的光照射所述靶区域以激发所述第二探针；(8)确定所述第二探针是否已经标记了所述靶区域中的细菌；其中，在所述靶区域中被所述第二探针标记的细菌被鉴定为革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。如果细菌没有被第一探针标记，则靶区域内没有细菌，并且没有必要进行我们的步骤(5)至(8)。如果靶区域中的细菌被第一探针标记，则进行步骤(5)至(8)确定该细菌是革兰氏阴性的或革兰氏阳性的。例如，如果第二探针适于标记革兰氏阴性细菌，则已经在步骤(4)中确定被第一探针标记并随后在步骤(8)中确定被第二探针标记的细菌是革兰氏阴性细菌。已经在步骤(4)中确定被第一探针标记并随后确定不被第二探针标记(步骤(8))的细菌是革兰氏阳性细菌。因此，本专利技术的方法允许确定靶区域中细菌的存在，并且如果靶区域中存在细菌，确定该细菌是革兰氏阴性的或革兰氏阳性的。此外，该方法允许确定靶区域中真菌的存在。在其中靶区域包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的实施方案中，第一探针将标记靶区域中的所有细菌，并且第二探针将标记革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌，从而直接地(通过标记它们)或间接地(通过不标记它们)鉴定两种革兰氏细菌。优选地，靶区域是患者内的组织的一部分，并且所述方法可以在体内进行。例如，靶区域可以是患者的肺的一部分，并且该方法可以使用支气管镜(bronchoscope)的工作通道进行，以将探针递送到靶区域、将光传送到靶区域以及检测来自靶区域的荧光。可选择地，可以使用单个仪器将探针递送到靶区域、将光传送到靶区域以及检测来自靶区域的荧光。例如，可以使用光学发射显微镜(OEM)诸如纤维共聚焦荧光显微镜(FCFM)检测来自患者的组织的荧光。靶区域可以在患者的皮肤上、关节中、循环系统中、上皮膜(linings)，诸如但不限于消化系统或生殖系统，或人中可通过术中程序接近的任何区域，并且探针可以通过内镜或例如通过直接喷雾来递送和/或观察。可选择地，靶区域可以是细胞培养物的一部分、组织样品诸如活组织检查样品或液体样品诸如体液样品，并且该方法可以在体外进行。优选地，在其中靶区域是患者的组织的一部分的实施方案中，患者是人类患者。然而，患者可以是非人动物，诸如例如马、羊、牛或啮齿动物。在医疗保健的许多领域，诸如危重或重症监护中，有必要鉴定肺部炎症是否为，例如，无菌的、细菌性的或真菌性的，并且如果是细菌性的，该细菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性的，或两者的混合物。然而，通常不可能使用标准方法诸如PET扫描来检查不能安全地移动的患者，特别是用呼吸机供氧的患者的炎症。因此，临床医师通常没有足够的信息来自信地诊断炎症的原因并开出合适的矫正措施。例如，如果炎症是无菌的，给予患者的抗生素就不会有帮助，并且可能会有不良的副作用。再次，如果细菌是革兰氏阴性的而给予患者仅对革兰氏阳性细菌有效的抗生素或反之，则抗生素将不会清除细菌并且可能具有不利的和有害的副作用。本专利技术的方法可以由临床医生在护理现场原位进行，并确定细菌和/或真菌是否存在于患者的靶区域内(诸如肺或肺的一部分内)，以及任何细菌是革兰阴性还是革兰氏阳性的。因此，本专利技术的方法有利地为临床医师提供了他们所需要的信息，以便自信地确定炎症的原因和确定最佳的行动步骤，诸如例如向患者给予适当的抗生素或抗真菌剂。如果在靶区域中检测到细菌并向患者给予合适的抗生素，则可以进行该方法以确定抗生素的功效。例如，细菌数量的减少或靶区域中不存在细菌通常指示治疗过程有效地清除细菌感染。类似地，如果在靶区域中检测到真菌并向患者给予合适的抗真菌剂，则可以进行该方法以确定抗真菌剂的功效。优选地，第一探针包含至少一个第一探针元件。第一探针可以包含至少两个第一探针元件。第一探针可以包含至少三个第一探针元件。所述第一探针元件或每个第一探针元件可以包含第一标签和第一结合部分。优选地，第二探针包含至少一个第二探针元件。第二探针可以包含至少两个第二探针元件。第二探针可以包含至少三个第二探针元件。所述第二探针元件或每个第二探针元件可以包含第二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种探针，所述探针包含标签和结合部分，其中所述结合部分适于结合革兰氏阴性细菌并且基本上不结合动物细胞或革兰氏阳性细菌。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.13 GB 1420222.01.一种探针，所述探针包含标签和结合部分，其中所述结合部分适于结合革兰氏阴性细菌并且基本上不结合动物细胞或革兰氏阳性细菌。2.根据任何权利要求1所述的探针，其中所述结合部分是多粘菌素部分，诸如全长多粘菌素(SEQIDNO.4)或其片段或变体。3.根据权利要求1或2之一所述的探针，其中所述标签是荧光团。4.根据权利要求1或2之一所述的探针，其中所述标签是放射性标签或磁共振标签。5.根据任一前述权利要求所述的探针，其中所述探针包括二级标签。6.根据权利要求3所述的探针，其中所述荧光团是环境敏感性荧光团。7.根据权利要求6所述的探针，其中所述荧光团为NBD。8.根据权利要求7所述的探针，其中所述探针包含多粘菌素部分和NBD。9.在靶区域中检测细菌和/或真菌的方法，所述方法包括步骤：(1)提供适于标记细菌和/或真菌的第一探针；(2)将所述第一探针递送到所述靶区域；(3)用适当波长的光照射所述靶区域以激发所述第一探针；(4)确定所述靶区域中的细菌和/或真菌是否已被所述第一探针标记；其中如果确定所述靶区域中的细菌已经被所述第一探针标记，则所述方法还包括步骤：(5)提供适于仅标记革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌的第二探针；(6)将所述第二探针递送到所述靶区域；(7)用适当波长的光照射所述靶区域以激发所述第二探针；(8)确定所述第二探针是否已经标记了所述靶区域中的细菌；其中，在所述靶区域中被所述第二探针标记的细菌被鉴定为革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述靶区域是患者内的组织的一部分，并且所述方法在体内进行。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述靶区域是肺的一部分、在患者的皮肤上、关节中、循环系统中、上皮膜，诸如但不限于消化系统或生殖系统。12.根据权利要求9所述的方法，其中所述靶区域是细胞培养物的一部分、组织样品诸如活组织检查样品、液体样品诸如体液样品、或医疗装置的一部分诸如导管或植入物，并且所述方法可以在体外进行。13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中本发明的方法可以由临床医师在原位、护理现场进行，并确定细菌和/或真菌是否存在于所述靶区域中，以及任何细菌是革兰阴性的或革兰氏阳性的。14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中如果在所述靶区域中检测到细菌并向患者给予适当的抗生素，则可以进行所述方法以确定所述抗生素的功效。15.根据任一前述权利要求所述的方法，其中如果在所述靶区域中检测到细菌并向患者给予适当的外科手术程序，则可以进行所述方法以确定所述程序的功效。16.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中如果在所述靶区域中检测到真菌并向患者给予适当的抗真菌剂，则可以进行所述方法以确定所述抗真菌剂的功效。17.根据权利要求9至16中任一项所述的方法，其中所述第一探针包含至少一个第一探针元件。18.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一探针元件或每个第一探针元件包含第一标签和第一结合部分。19.根据权利要求9至18中任一项所述的方法，其中所述第二探针包含至少一个第二探针元件。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第二探针元件或每个第二探针元件包含第二标签和第二结合部分。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述第一标签和/或所述第二标签是荧光团，并且所述第一探针和/或所述第二探针适于荧光标记细菌和/或真菌。22.根据权利要求20所述的方法，其中所述第一标签和/或所述第二标签是放射性标签。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一标签和/或所述第二标签是磁共振标签。24.根据权利要求9至23中任一项所述的方法，其中所述第一探针和/或所述第二探针包含二级标签。25.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一探针包含第一荧光团且所述第二探针包含第二荧光团。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一荧光团和/或所述第二荧光团发射光谱的近红外或红外范围内的光。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述荧光团可通过光声成像检测。28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述第一荧光团和/或所述第二荧光团是环境敏感性荧光团，使得所述第一荧光团和/或所述第二荧光团的荧光的强度/量子收率取决于所述第一荧光团和/或所述第二荧光团的环境。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一荧光团和/或所述第二荧光团的荧光的量子收率或强度在疏水性环境诸如细胞膜中较高。30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述第一荧光团和/或所述第二荧光团独立地为7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(NBD...

【专利技术属性】
技术研发人员：马克·布拉德利，安娜玛丽亚·海伦娜·利林坎普夫，尼古劳斯·阿夫洛尼蒂斯，马克·文德雷利·埃斯科巴尔，尼尔·亚历山大·麦克唐纳，克里斯多佛·哈斯莱特，卡恩瓦尔迪普·达利瓦，蒂莫西·西蒙·沃尔什，
申请(专利权)人：爱丁堡大学董事会，
类型：发明
国别省市：英国,GB