具备双受体激动剂活性的融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及包含两个多肽的异源二聚体融合蛋白，所述第一多肽包含第一肽(P1)、接头(L1)和Fc区(F1)，所述第二多肽包含第二肽(P2)、接头(L2)和Fc区(F2)，其中P1和P2各自独立选自GLP‑1、GLP‑1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽和毒蜥外泌肽类似物；其中F选自IgG Fc、IgA Fc、IgE Fc、IgGM Fc及其类似物；其中所述肽的C‑末端通过接头L与所述Fc区F的N‑末端相连接。在一个实施例中，本文公开的融合蛋白对GLP‑1受体、GIP受体和胰高血糖素受体中的至少两种受体有激动剂活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具备双受体激动剂活性的融合蛋白相关申请的交叉引用本专利申请根据35U.S.C.§119(e)要求优先权，并有权享受2014年11月13日提交的美国临时专利申请62/079,518的申请日的权益，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中。序列表的引用经USPTOEFS-WEB服务器提交的以下电子版序列表的全部内容，如MPEP§1730II.B.2(a)(C)中所授权和阐述的，在此通过引用的方式整体明确并入本文中用于所有目的。序列表在电子提交的文本文件上标识如下：文件名：3IPAG3-0004USSeqList_ST25；创建日期：2015年11月13日；大小(字节)：100KB。介绍据估计，全世界有超过3.7亿的糖尿病患者，其中约90％患有2型糖尿病。通常，2型糖尿病患者仍产生胰岛素，但是胰岛素不能被身体细胞有效地使用。这主要是因为响应于上升的血糖水平产生的胰岛素的量不足以允许细胞有效摄取葡萄糖并因而降低血糖水平。前胰高血糖素原是158个氨基酸的前体多肽(参见，例如，sp|P01275|GLUC_HUMANGlucagon，2014年11月10日访问，参考序列为178个氨基酸的肽，包括20个氨基酸的信号肽)，其在不同组织中经加工形成许多不同的胰高血糖素原衍生肽，包括胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和胃泌酸调节素(OXM)。这些肽参与多种生理功能，包括葡萄糖体内平衡、胰岛素分泌、胃排空和肠生长以及食物摄取调节。胰高血糖素为对应于前胰高血糖素原的氨基酸第33至61位的29个氨基酸的肽，而GLP-1以对应于前胰高血糖素原的氨基酸第72至108位的37个氨基酸的肽形式产生。GLP-1(7-36)酰胺或GLP-1(7-37)酸是GLP-1的生物学有效形式，其对GLP-1受体表现出基本上相等的活性。GLP-1在调节胰岛素分泌、血糖水平以及新陈代谢中发挥重要作用。遗憾的是，它由于DPIV降解以及分子量小，故具有非常短的循环半衰期。为了保持GLP-1活性同时还具有不同程度的对DP-IV降解的抵抗力，已经开发了几种形式的GLP-1类似物。例如GLP-1类似物偶联物和融合蛋白的额外修饰显著增加它们在体内的半衰期。所述修饰包括聚乙二醇化、GLP-1类似物-白蛋白融合蛋白和GLP-1类似物-Fc融合蛋白。由于GLP-1产品用于治疗糖尿病，而糖尿病是一种慢性疾病，故使免疫原性降至最弱也非常重要。市面上已有几种GLP-1类似物成功推出，其中包括VICTOZATM(NovoNordisc)和BYETTATM(BristolMyersSquib)。许多GLP-1类似物处于临床开发的不同阶段。其中一个值得关注的品种是DULAGLUTIDETM(EliLilly)，其已成功完成3期临床开发，与同类品种相比具有突出的疗效数据。DULAGLUTIDETM是GLP-1类似物-Fc融合蛋白。如专利EP1641823中所公开的，为了获得对二肽基肽酶IV(DP-IV)降解的抵抗力，其GLP-1类似物结构域在第8位的氨基酸处含有甘氨酸取代(即“Gly(8)”)。其Fc结构域是IgG4Fc类似物。对融合蛋白进行几种修饰以使Fc功能最小化或消除并降低潜在的免疫原性。葡萄糖依赖性促胰岛素释放多肽(又称胃抑制性多肽，下文称为“GIP”)为42个氨基酸的肽，其具有如2014年11月9日所访问的＞sp|P09681|氨基酸第52-93位序列。像GLP-1一样，GIP可诱导葡萄糖依赖性胰腺β-细胞胰岛素分泌。GIP还具有胰腺外活性，其进一步促进葡萄糖降低。虽然有相似之处，但GLP-1和GIP通过两种不同的机制起作用。在第2位氨基酸具有甘氨酸或丝氨酸取代(即“Gly(2)”或“Ser(2)”)的GIP类似物对DP-IV降解的抵抗力增强(Gault等人，ImprovedbiologicalactivityofGly2-andSer2-substitutedanaloguesofglucose-dependentinsulinotrophicpolypeptide，JEndocrinol.176(1)：133-141，2003)。胰高血糖素是由胰腺分泌的肽激素，其提高血糖水平。当血糖水平降至很低时，胰腺释放胰高血糖素。胰高血糖素促使肝脏将储存的糖原转化为葡萄糖，释放到血液中。高血糖水平刺激胰岛素的释放。胰岛素允许胰岛素依赖性组织摄取和使用葡萄糖。因此，胰高血糖素和胰岛素成为将血糖水平保持在稳定水平的反馈系统的一部分。GLP-1类似物在患者中显示有限的体重减轻活性。GLP-1、GIP和/或胰高血糖素受体的双重活性激动剂在治疗糖尿病和相关疾病特别是体重减轻方面显示出优异的功效。例如，据报道对GLP-1/GIP两种受体有有效的、均衡的共激动作用的肽在动物和人类研究中显示出协同和优异的功效(Finan等人，Unimoleculardualincretinsmaximizemetabolicbenefitsinrodents，monkeys，andhumans，Sci.Transl.Med.5(209)：209ra151，2013)。再例如，双重GLP-1/胰高血糖素受体(GLP1R/GCGR)激动剂在动物研究中显示显著的体重减轻，但没有高血糖症的迹象(Day等人，AnewglucagonandGLP-1co-agonisteliminatesobesityinrodents，Nat.Chem.Biol.(10)：749-757，2009)。胃泌酸调节素对GLP-1和胰高血糖素受体都具有双重激动剂活性，不过与GLP-1和胰高血糖素相比活性较低。基于胃泌酸调节素肽的双重功能，其已被积极研究作为用于治疗肥胖的药物。然而，据报道，包括胃泌酸调节素的抗肥胖药物具有短的体内半衰期和弱的治疗功效，即使以高剂量每天施用三次。因而为改善胃泌酸调节素的体内半衰期或对肥胖的治疗效果已经作了诸多努力。例如，韩国专利925017公开了包括胃泌酸调节素作为用于治疗超重人的活性成分的药物组合物，其通过口服、胃肠外、粘膜、直肠、皮下或经皮途径施用。在单个肽中，许多肽对GLP-1/GIP受体或GLP-1/胰高血糖素受体具有双重激动剂活性(美国专利申请公布文件2013/0090286)。所述肽通常以化学方法合成并且用聚乙二醇化修饰或与脂肪酸链连接以增加它们在体内的半衰期。所述肽也可以与Fc片段融合或偶联产生肽-Fc融合蛋白，以通过二聚化增强其活性并通过Fc结构域改善它们的体内半衰期。IgGFc可以用作载体以延长治疗性肽例如GLP-1类似物的体内半衰期。IgGFc融合蛋白具有范围从几天到超过一周的体内半衰期(AavangTibbie等人，LongerActingGLP-1ReceptorAgonistsandthePotentialforImprovedCardiovascularOutcomes，AReviewofCurrentLiterature，ExpertRev.Endocrinol.Metab.8(3)：247-259，2013)。另一方面，全抗体分子也可以用作治疗性肽的载体。抗体分子可以具有3周以上的体内半衰期(Hinton等人，Aneng本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种二聚体融合蛋白，其包含两个多肽，第一多肽包含第一肽(P1)、接头(L1)和Fc区(F1)，第二多肽包含第二肽(P2)、接头(L2)和Fc区(F2)，其中P1和P2各自独立为GLP‑1、GLP‑1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽(exendin)或毒蜥外泌肽类似物；其中F1和F2各自独立为IgG Fc、IgG Fc类似物、IgA Fc、IgA Fc类似物、IgM Fc、IgM Fc类似物、IgD Fc、IgD Fc类似物、IgE Fc、IgE Fc类似物、SEQ ID NO：35和/或SEQ IDNO：35类似物；且其中所述肽P1和P2的C‑末端通过接头L1和L2与Fc区F1和F2的N‑末端相连接。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.13 US 62/079,5181.一种二聚体融合蛋白，其包含两个多肽，第一多肽包含第一肽(P1)、接头(L1)和Fc区(F1)，第二多肽包含第二肽(P2)、接头(L2)和Fc区(F2)，其中P1和P2各自独立为GLP-1、GLP-1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽(exendin)或毒蜥外泌肽类似物；其中F1和F2各自独立为IgGFc、IgGFc类似物、IgAFc、IgAFc类似物、IgMFc、IgMFc类似物、IgDFc、IgDFc类似物、IgEFc、IgEFc类似物、SEQIDNO：35和/或SEQIDNO：35类似物；且其中所述肽P1和P2的C-末端通过接头L1和L2与Fc区F1和F2的N-末端相连接。2.如权利要求1所述的二聚体融合蛋白，其中所述GLP-1、GLP-1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽和/或毒蜥外泌肽类似物具有一个添加的或用于取代天然存在N-末端氨基酸的N-末端氨基酸His或dHis。3.如权利要求1或2所述的二聚体融合蛋白，其中所述GLP-1、GLP-1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽和/或毒蜥外泌肽类似物的N-末端第二个氨基酸为Gly、氨基异丁酸(Aib)、D-Ala、D-Ser、D-Gly或D-Val。4.如权利要求1-3中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中P1为GLP-1类似物，所述GLP-1类似物的N-末端为His或D-His；所述GLP-1类似物的第二个氨基酸选自Gly、氨基异丁酸(Aib)、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val；P2选自GIP、GIP类似物、胰高血糖素和胰高血糖素类似物。5.如权利要求1-3中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中P1或P2为GLP-1类似物，所述GLP-1类似物包含选自由SEQIDNO：14-19及与SEQIDNO：14-19中的一个或多个氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。6.如权利要求1-3中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中P1或P2为GLP-1类似物，所述GLP-1类似物包含选自由SEQIDNO：14-19及与SEQIDNO：14-19中的一个或多个氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。7.如权利要求1-6中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中P1或P2为GIP类似物，所述GIP类似物包含选自SEQIDNO：20、21及与SEQIDNO：20或21中的一个或多个氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的氨基酸序列的氨基酸序列。8.如权利要求1-6中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中P1或P2为GIP类似物，其中所述GIP类似物包含选自由SEQIDNO：20、21及与SEQIDNO：20或21中的一个或多个氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。9.如权利要求1-8中任一项所述的二聚体融合蛋白，其对所述GLP-1受体、GIP受体及胰高血糖素受体有激动剂活性。10.如权利要求1-8中任一项所述的二聚体融合蛋白，其对所述GLP-1受体、GIP受体及胰高血糖素受体中的任两种受体有双重激动剂活性。11.如权利要求1-10中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述IgGFc为lgG1Fc、lgG2Fc或lgG4Fc。12.如权利要求1-11中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者都包含lgG4Fc类似物，F1或F2包含选自以下序列的氨基酸序列：SEQIDNO：31-35及42-71中的任一序列、与SEQIDNO：31-35及42-71中的一个或多个序列相比具有l、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列、与SEQIDNO：31-35及42-71中的一个或多个序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。13.如权利要求1-12中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者都包含GLP-1类似物-Fc融合蛋白，所述GLP-1类似物-Fc融合蛋白包含SEQIDNO：37的氨基酸序列、与SEQIDNO：37相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列、与SEQIDNO：37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。14.如权利要求1-13中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者都包含GIP类似物-Fc融合蛋白，所述GIP类似物-Fc融合蛋白包含SEQIDNO：36的氨基酸序列、与SEQIDNO：36相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列、与SEQIDNO：36具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。15.如权利要求1-14中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕越峰，卢建丰，王爱君，
申请(专利权)人：江苏奥赛康药业股份有限公司，奥美药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32